單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）是一項(xiàng)突破性技術(shù)，極大地提高了研究生物系統(tǒng)的分辨率。現(xiàn)在可以將復(fù)雜的組織分解成它們各自的細(xì)胞類型，并了解它們的基因表達(dá)模式。此外，現(xiàn)在不僅可以表征細(xì)胞群之間的異質(zhì)性，而且可以表征細(xì)胞內(nèi)的異質(zhì)性，通常這會(huì)對定義細(xì)胞類型的概念提出挑戰(zhàn)。scRNA-seq技術(shù)已迅速成熟，但經(jīng)常是封閉的商業(yè)系統(tǒng)或需要專門的設(shè)備。最近， 瑞典Karolinska研究所的HagemannJensen博士及其同事報(bào)告了Smart-seq3技術(shù)的開發(fā)，這使得通用的Smart-seq化學(xué)方法更新迭代。

與Smart-seq2相比，Smart-seq3的靈敏度大大提高，通常每個(gè)細(xì)胞可檢測數(shù)千個(gè)基因。此外，該協(xié)議現(xiàn)在實(shí)現(xiàn)了涵蓋全長度記錄副本和5’UMI標(biāo)記的獨(dú)特混合方法。這樣既可以進(jìn)行精確的定量mRNA測量，又可以保留覆蓋全長度的獨(dú)特能力，以研究其他剪接異構(gòu)體和表達(dá)遺傳變異。

實(shí)際上，Smart-seq3庫可以通過相對便宜的試劑成本生成，且不需要特定于平臺(tái)的設(shè)備。然而，通過集成Formulatrix的MANTIS?液體處理器（圖1），可以自動(dòng)執(zhí)行Smart-seq3協(xié)議的大多數(shù)操作步驟，以提高通量，減少死體積并減少移液步驟，降低移液器吸頭成本。

圖 1: MANTIS液體處理器

在本應(yīng)用指南中，我們將演示在庫準(zhǔn)備工作流程中，使用MANTIS的關(guān)鍵步驟。

Smart-seq3是一種獨(dú)特的全長度定量scRNA -seq協(xié)議。

Smart-seq3利用既定的96孔及384孔微孔板塊進(jìn)行庫準(zhǔn)備。首先，單細(xì)胞需要被分離并放置到含有裂解緩沖液的孔中。

通常情況下，將通過FACS技術(shù)進(jìn)行篩選，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都可以通過其核心設(shè)備來實(shí)現(xiàn)，也可以通過顯微解剖或激光捕獲。直到進(jìn)一步處理前，裂解板可以-80°C保存。首先，mRNA將被反向轉(zhuǎn)錄，第一鏈cDNA模板與含有umi的5 ‘寡核苷酸(TSO)進(jìn)行交換。然后，用PCR進(jìn)行全長cDNA擴(kuò)增，擴(kuò)增后的cDNA用磁珠純化。通過這種純化，使用熒光DNA結(jié)合染料對cDNA進(jìn)行定量，以便準(zhǔn)確地使整個(gè)板上的cDNA濃度標(biāo)準(zhǔn)化。標(biāo)準(zhǔn)化cDNA的一部分，采用標(biāo)記法和PCR法，進(jìn)行庫準(zhǔn)備工作。在匯集所有索引庫DNA后，可以在任何傳統(tǒng)的Illumina平臺(tái)上執(zhí)行測序。

Smart-seq3協(xié)議是完全開源的，所有深入步驟和試劑數(shù)量都已存儲(chǔ)在協(xié)議中。

使用MANTIS低容量(LV)和高容量(HV)芯片有效分配試劑

單細(xì)胞RNA-seq庫制備的關(guān)鍵目標(biāo)是在擴(kuò)增前避免mRNA分子丟失。從理論上講，損失可能發(fā)生，核酸可能被吸附在實(shí)驗(yàn)室通用塑料的表面，如移液管吸頭。利用MANTIS的非接觸分配，消除手動(dòng)液體處理步驟，從而避免了這個(gè)潛在的問題。此外，快速分配速度最大限度地減少了逆轉(zhuǎn)錄之前所花費(fèi)的時(shí)間，甚至可以將保持板與兼容冷塊結(jié)合，獲得最佳的樣本溫度。另一方面，非接觸式分配也減少了吸頭的支出，每384孔板的用量相當(dāng)可觀。此 外，MANTIS低容量(LV)和高容量(HV)芯片的低死體積節(jié)省了寶貴的試劑用量 (圖2)。

圖2：憑借MANTIS的低死體積，及用移液管吸頭直接裝載試劑和，保證了最少的試劑浪費(fèi)，例如分配逆轉(zhuǎn)錄母料混合物。

使用MANTIS持續(xù)流量（CF)，易于測量濃度和標(biāo)準(zhǔn)化。

在成功生成預(yù)擴(kuò)增的cDNA庫后(圖3)，Smart-seq3的研究人員運(yùn)用可選步驟，在濃度標(biāo)準(zhǔn)化后確定所有擴(kuò)增庫的DNA濃度。

圖3:在安捷倫生物分析儀上運(yùn)行的一個(gè)成功的Smart-seq3 cDNA庫的例子。

在最終庫準(zhǔn)備步驟時(shí)輸入相同的DNA濃度，確保了更好的下游均勻性和序列質(zhì)量。通過利用MANTIS 的持續(xù)流量功能，將大量染色的熒光DNA溶液分配 至適合熒光強(qiáng)度測量的黑色微孔板。在獲得并計(jì)算出每孔中的cDNA濃度之后，創(chuàng)建Excel或 OpenOffice電子表格計(jì)算出所需要的不同水量，將cDNA調(diào)整到設(shè)定的濃度。這一步驟可以在已經(jīng)裝有預(yù)擴(kuò)增庫的孔板上完成，也可以使用新的孔板。MANTIS的另一個(gè)獨(dú)特之處在于，可以直接導(dǎo)入包含整個(gè)孔板的體積分配值的電子表格(圖4)。MANTIS軟件允許實(shí)時(shí)計(jì)算和自動(dòng)創(chuàng) 建分配列表，包括根據(jù)直接從微波微流控孔板讀取器的輸出中導(dǎo)入并標(biāo)準(zhǔn)化的濃度測量。這 使得不同的體積液體可以被快速且準(zhǔn)確地分配到每一個(gè)384孔板中。CF或HV芯片都可以用來 分配這些不同的體積。

圖4:標(biāo)準(zhǔn)化cDNA濃度的分配布局，可以通過電子表格計(jì)算將需要分配的不同水量導(dǎo)入MANTIS軟件，也可以使用內(nèi)置的標(biāo)準(zhǔn)化向?qū)С绦蛑苯訉?dǎo)入孔板讀取器的輸出值。

可負(fù)擔(dān)得起的測序庫
為了創(chuàng)建測序準(zhǔn)備庫，Smart-seq3依賴轉(zhuǎn)位子Tn5將預(yù)擴(kuò)增的cDNA切成更小的片段。在酶裂解過程中，Tn5酶將預(yù)先裝載的寡糖插入切割位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)雙索引PCR。考慮到在該方法中應(yīng)用的反應(yīng)體積的穩(wěn)健小型化，使用MANTIS分配試劑及標(biāo)記反應(yīng)及后續(xù)PCR所需的酶。這大大降低了變異性，也降低了Tn5酶絕對反應(yīng)的成本。

總的來說，在scRNA-seq工作流程中使用MANTIS，大大減少了所需的塑料噴嘴損耗數(shù)量。從開始到結(jié)束，減少至少8盒384孔移液噴嘴使用量，通常會(huì)為用戶節(jié)省250至400歐元。此外，MANTIS將工作體積、成本顯著降低到每個(gè)細(xì)胞0.5-1.0歐元。

使用Smart-seq3進(jìn)行高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組測量
在完成庫準(zhǔn)備工作流程后，Smart-seq3兼容任何通用 Illumina測序平臺(tái)。卡羅林斯卡研究所的研究人員通過 HEK293T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證明了他們的單細(xì)胞RNA測序方法的高質(zhì)量。在平均測序深度為180萬reads的下，質(zhì)量數(shù)據(jù)現(xiàn)實(shí)，大部分的基因讀長證明了人類參考基因組的外顯子和內(nèi)含子區(qū)域，與成熟和新生的mRNA存在一致( 圖5)。此外，庫的準(zhǔn)備工作對檢測RNA分子表現(xiàn)出極高的敏感性，從而檢測到大量基因。

圖5：典型的Smart-seq3實(shí)驗(yàn)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)。在384 孔板中對HEK293T細(xì)胞進(jìn)行解碼，平均測序深度為每個(gè)細(xì)胞180萬reads。

卡羅林斯卡學(xué)院的研究人員表明，在工作流程中使用 MANTIS，用Smart-seq3從單細(xì)胞中創(chuàng)建測序庫，是一種獲得高質(zhì)量、高通量、高重復(fù)性的好方法，同時(shí)又減少人工勞動(dòng)、塑料品消耗和總成本。此外，MANTIS技術(shù)展示了應(yīng)用于其他現(xiàn)有的單細(xì)胞RNA測序方法的潛力及多功能性，并有助于開發(fā)新的研究方法。

致謝
富默樂要感謝Christoph Ziegenhein和Michael Hagemann- Jensen以及Karolinska研究所的同事，感謝他們在評估MANTIS分液技術(shù)在Smart-seq3 流程中運(yùn)用的做出的貢獻(xiàn)，以及在此應(yīng)用說明中提供的證明結(jié)果。