使用MANTIS?液體處理器，解決了處理單細(xì)胞樣品特有的問(wèn)題，提高了新工作流程的定量準(zhǔn)確性

量化單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白質(zhì)歷來(lái)依靠免疫抗體技術(shù)，如CyTOF、單細(xì)胞免疫印跡和鄰近延伸試驗(yàn)。盡管有效，但這些方法在生產(chǎn)通量上受到限制，且它們的準(zhǔn)確性可能由于缺乏高度特異性抗體而降低。此外，和任何用于研究細(xì)胞的免疫分析方法一樣，這些技術(shù)都面臨著與細(xì)胞通透性和表位可及性相關(guān)的挑戰(zhàn)。

為了解決這些問(wèn)題，東北大學(xué)斯拉沃夫實(shí)驗(yàn)室的研究人員最近開發(fā)了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜 (SCoPE-MS)，這是一種使用同位素標(biāo)記定量 (TMT)標(biāo)記單細(xì)胞多肽的技術(shù)。通過(guò)在納米液相色譜分離之前將標(biāo)記的肽與標(biāo)記的載體肽混合， SCoPE-MS被證明可以極大地減少樣品損失——當(dāng)處理低豐度材料時(shí)如單細(xì)胞時(shí)，這是一個(gè)關(guān)鍵的考慮因素。對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞分化中的1000多種蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，并將這些數(shù)據(jù)與mRNA表達(dá)進(jìn)行比較，不僅為SCoPE-MS定 量表征單細(xì)胞基因調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，并且強(qiáng)調(diào)了它根據(jù)蛋白質(zhì)組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類的潛力。

隨著自動(dòng)化和小型化樣品制備的引入2，SCoPE-MS已經(jīng)發(fā)展成為SCoPE2。除了提供更好的定量精度外，SCoPE 2有利于降低成本、減少操作時(shí)間，顯著提高樣品制備和測(cè)量的通量。MANTIS?液體處理器(圖1)是這一成功的關(guān)鍵，提供了可靠的亞微升容量分配，甚至是出了名難分配的液體，如用于存儲(chǔ)TMT的100%乙腈。

圖1：MANTIS?液體處理器

單細(xì)胞樣品處理的獨(dú)特挑戰(zhàn)

樣本低通量是單細(xì)胞研究人員面臨的主要問(wèn)題。一個(gè)“正常”的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)組通常 只有50-500pg，質(zhì)量上限為廣泛使用的HeLa細(xì)胞系，而像單核細(xì)胞這樣的細(xì)胞含有較少的蛋白質(zhì)。因此，進(jìn)行一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)需要將數(shù)十個(gè)、數(shù)百個(gè)甚至數(shù)千個(gè)樣品結(jié)合起來(lái)，以獲得足夠的數(shù)量進(jìn)行分析。反之，這給并行樣本處理帶來(lái)了挑戰(zhàn)，必須確保將樣本損失降到最低，以避免時(shí)間、資源的浪費(fèi)。

綜合處理這些問(wèn)題的方法

斯拉沃夫?qū)嶒?yàn)室的研究人員已經(jīng)確定了幾種克服上述挑戰(zhàn)的方法。為了解決低樣品豐度的問(wèn)題，設(shè)計(jì)了減少表面損失的措施，允許使用小體積樣品。細(xì)胞裂解方法的改變省去了在質(zhì)譜分析之前的清理步驟，這是現(xiàn)有質(zhì)譜方法中的一個(gè)關(guān)鍵步驟，通常會(huì)損失大量的蛋白質(zhì)。多孔板的使用有助于確保分析是可靠和穩(wěn)健的。最后，自動(dòng)化的引入是消除人工樣本處理錯(cuò)誤和增加通量的基礎(chǔ)。

SCoPE2工作流程

為了解MANTIS?液體處理器是如何運(yùn)用于SCoPE2中，掌握SCoPE2工作流程是很重要的(圖2) 。下面展示的工作流總結(jié)，用橙色標(biāo)出了使用MANTIS?液體處理器的階段。
 

SCoPE2 工作流程：

• 用1 μL含25 pmol Waters MassPREPTM（一種簡(jiǎn)單的5肽混合物，有助于鈍化塑料制品）的純水制備384-孔板。

• 使用細(xì)胞分揀器將單個(gè)細(xì)胞分配到孔板中，以實(shí)現(xiàn)隨機(jī)布局(圖3)，并在-80°C冷凍孔板。

• 將孔板快速轉(zhuǎn)到PCR機(jī)上，并在90°C加熱10分鐘溶解細(xì)胞。

• 慢速旋轉(zhuǎn)孔板，冷卻，在水浴聲納器孵育5分鐘，然后再次旋轉(zhuǎn)。

• 每孔加入0.2 μL主混合液（00mM TEAB, 10ng /μL胰蛋白酶，0.25單位/μL苯并酮酶），將蛋白分解為多肽，37℃孵化3小時(shí)。

• 每孔加入0.5 μL 22 mM TMT（100%乙腈）標(biāo)記多肽，室溫孵化1小時(shí)。

• 每孔加入0.2μL0.5％羥胺，淬滅任何未反應(yīng)的TMT，室溫孵化30分鐘。

• 使用多道移液管組合樣品，轉(zhuǎn)移到自動(dòng)進(jìn)樣器玻璃插入瓶中，集中干燥。

• 樣品重新懸浮于1.2 μL 0.1%甲酸溶液中，用于LC-MS/MS分析。

圖2：SSsc工作流。使用MANTIS?液體處理器進(jìn)行的步驟以橙色顯示。

使用MANTIS?液體處理器提高了定量準(zhǔn)確性

通過(guò)在原有的SCoPE-MS工作流程中引入自動(dòng)化、小型化的樣品制備，斯拉沃夫?qū)嶒?yàn)室的研究人員獲益于顯著增加的實(shí)驗(yàn)通量。使用SCoPE2，可在短短10天的儀器運(yùn)行時(shí)間內(nèi)量化1018個(gè)單個(gè)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中超過(guò)2700個(gè)蛋白質(zhì)，量化的蛋白質(zhì)允許通過(guò)細(xì)胞類型識(shí)別單個(gè)細(xì)胞。

MANTIS?液體處理器是為SCoPE2工作流程四個(gè)關(guān)鍵步驟提供可靠的亞微升分配的重要組成部分，即為細(xì)胞分選板的準(zhǔn)備、蛋白質(zhì)分解、肽標(biāo)記和TMT反應(yīng)的猝滅。MANTIS?液體處理器的幾個(gè)重要特性使SCoPE2選擇了它，首先是它的單噴嘴結(jié)構(gòu)和非接觸式分配能力。由于每個(gè)孔包含不同的細(xì)胞類型（圖3），必須避免交叉污染。

圖3:在MANTIS?液體處理器上分配的隨機(jī)布局示例：綠色-載體，藍(lán)色-細(xì)胞1型，紅色-細(xì)胞2型，黑色-控制（無(wú)細(xì)胞）。

MANTIS?液體處理器的理想特性是它與各種試劑的兼容性。雖然分配水溶液對(duì)大多數(shù)液體處理平臺(tái)沒有什么問(wèn)題，但準(zhǔn)確分配亞微升體積的困難液體，如100%乙腈（用于存儲(chǔ)和稀釋 TMT標(biāo)簽）是具有相當(dāng)挑戰(zhàn)性的。最后，通過(guò)高度直觀的軟件，可以方便且快捷地集成到現(xiàn)有的工作流程中，MANTIS?液體處理器使斯拉沃夫?qū)嶒?yàn)室的研究人員能夠繼續(xù)開發(fā)SCoPE2，不會(huì)因?yàn)閮x器設(shè)置造成延誤。