研究團(tuán)隊(duì)在國際頂級光學(xué)期刊《Light : Science & Applications》上發(fā)表了題為《Mirror-enhanced scanning light-field microscopy for long-term high-speed 3D imaging with isotroPIc resolution》的研究論文。這項(xiàng)由Bo Xiong（熊博）、Tianyi Zhu（朱天奕）、Jiamin Wu（吳嘉敏）、QionghAI Dai（戴瓊海）等共同完成的工作，首次實(shí)現(xiàn)了在單物鏡、低光照條件下，對活體樣本進(jìn)行小時(shí)級毫秒分辨率、各向同性400納米的三維動(dòng)態(tài)觀測。

重要發(fā)現(xiàn)
01軸向分辨率突破性提升
“缺失錐”難題的破解：
傳統(tǒng)光場顯微鏡（LFM）因光學(xué)傳遞函數(shù)的“缺失錐”問題，軸向分辨率（約1.5μm）遠(yuǎn)低于橫向分辨率（約0.4μm），導(dǎo)致Z軸圖像模糊（圖1b）。MiSLFM的核心創(chuàng)新在于利用樣本下方傾斜放置的鏡面（圖1a）。樣本發(fā)出的熒光被鏡面反射后再次被物鏡捕獲，相當(dāng)于在單次曝光內(nèi)同時(shí)獲取了樣本的原始視圖和其鏡像視圖。

鏡像約束算法：
團(tuán)隊(duì)開發(fā)了多視角相位空間反卷積算法（圖1c）。該算法首先進(jìn)行初始三維重建，然后精確估計(jì)鏡面位置，最后在反卷積過程中強(qiáng)制施加原始圖像與鏡像圖像的對稱性約束。這種計(jì)算策略充分利用了鏡像視圖提供的額外空間頻率信息，有效填補(bǔ)了傳統(tǒng)LFM的“缺失錐”。

各向同性分辨率實(shí)現(xiàn)：
通過對亞衍射極限熒光珠（40倍/0.8NA物鏡）成像驗(yàn)證，MiSLFM在橫向和軸向上均實(shí)現(xiàn)了約0.4μm的分辨率（圖S2）。模擬實(shí)驗(yàn)（圖1d,e）和不同角度鏡面測試（圖S3）進(jìn)一步證實(shí)，在鏡面傾斜45°時(shí)，軸向分辨率達(dá)到最佳，與橫向分辨率相當(dāng)，真正實(shí)現(xiàn)了三維各向同性成像。實(shí)際細(xì)胞成像（L929細(xì)胞膜染色，圖1b；NRK細(xì)胞膜與線粒體雙色成像，圖2a-c）清晰顯示，MiSLFM能分辨細(xì)胞間精細(xì)的膜接觸結(jié)構(gòu)（圖2b紅箭頭）和線粒體的清晰軸向分布（圖2c黃箭頭），這是傳統(tǒng)sLFM無法做到的。

毫瓦級超低光照成像：
在NRK活細(xì)胞（膜-線粒體雙標(biāo)）實(shí)驗(yàn)中，MiSLFM在3.95mW/mm2(488nm)和1.99mW/mm2(561nm)的低光強(qiáng)下，以2Hz體積速率連續(xù)成像20分鐘。線粒體通道熒光強(qiáng)度幾乎無衰減，細(xì)胞膜通道僅衰減10%（圖2e）。

14小時(shí)細(xì)胞活性追蹤：
在更嚴(yán)苛的B16-GFP細(xì)胞長時(shí)程實(shí)驗(yàn)中，MiSLFM僅使用0.22mW/mm2(488nm)光強(qiáng)，每6分鐘成像一次（每次曝光2.25秒），持續(xù)記錄14小時(shí)（圖3）。細(xì)胞保持良好活性，細(xì)胞間接觸穩(wěn)定存在（圖3c）。相比之下，相同條件下共聚焦顯微鏡（0.44mW/mm2，但掃描時(shí)間長）僅能維持3小時(shí)成像，且細(xì)胞在11小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重光漂白（>90%衰減，圖S4），細(xì)胞形態(tài)變圓、接觸消失。MiSLFM顯著降低了光損傷，為研究緩慢生物過程（如細(xì)胞分裂、遷移）提供了可能。

斑馬魚血流毫秒級追蹤：
在體成像挑戰(zhàn)更大。MiSLFM使用20倍/0.5NA水浸物鏡，在0.54mW/mm2(488nm,血管)和0.71mW/mm2(561nm,血細(xì)胞)的超低光強(qiáng)下，以18Hz體積速率（相機(jī)幀頻18Hz，結(jié)合3x3掃描與滑動(dòng)窗口重建）對3天斑馬魚幼體尾部血流進(jìn)行成像（圖5a,b）。MiSLFM清晰呈現(xiàn)了血管壁在軸向的分布（圖5c），并對高速流動(dòng)的血細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了各向同性分辨率成像（圖5e,g）。自動(dòng)追蹤（Imaris軟件）結(jié)果顯示，在相同區(qū)域內(nèi)，MiSLFM檢測到的血細(xì)胞數(shù)量（8個(gè)）遠(yuǎn)多于sLFM（2個(gè)）（圖S5），證明了其在活體高速三維追蹤中的魯棒性和準(zhǔn)確性。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01單物鏡攻克缺失錐
僅需在現(xiàn)有寬場顯微鏡上加裝一面定制角度的鏡片和樣品腔，無需復(fù)雜多物鏡光路（如4Pi顯微鏡、多視角光片顯微鏡），即利用光場顯微鏡固有的大景深特性，通過鏡面反射天然生成正交的第二視角，從根本上解決了傳統(tǒng)LFM軸向分辨率低的核心缺陷，首次在單物鏡系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)近各向同性分辨率（~400nm）。

03高速與分辨率的統(tǒng)一
繼承掃描光場顯微（sLFM）的毫秒級三維成像速度，并通過鏡像約束算法有效抑制反卷積偽影。成功應(yīng)用于快速運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞器（如收縮泡）、高速血流等傳統(tǒng)方法難以清晰捕捉的動(dòng)態(tài)過程，為生命活動(dòng)的瞬時(shí)三維機(jī)制研究提供了利器。

總結(jié)與展望
鏡面增強(qiáng)掃描光場顯微技術(shù)（MiSLFM）通過一項(xiàng)看似簡單卻極為巧妙的鏡面設(shè)計(jì)，結(jié)合強(qiáng)大的計(jì)算成像算法，成功打破了高速三維活體成像在分辨率、速度與光毒性之間的傳統(tǒng)權(quán)衡。它首次在單物鏡系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了長時(shí)程（小時(shí)級）、高速度（毫秒級）、低光毒（毫瓦級光照）下的三維各向同性分辨率成像，為觀測細(xì)胞器相互作用、囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞間通訊、胚胎發(fā)育、神經(jīng)活動(dòng)以及高速血流動(dòng)力學(xué)等生命活動(dòng)的三維動(dòng)態(tài)全景打開了前所未有的窗口。

未來，MiSLFM技術(shù)有望在多個(gè)方向深化發(fā)展：優(yōu)化鏡面角度設(shè)計(jì)與樣品腔以適應(yīng)更高NA物鏡和更厚組織成像；開發(fā)更快速、更智能的重建算法以處理更大規(guī)模數(shù)據(jù)；探索其在腦科學(xué)（全腦神經(jīng)活動(dòng)圖譜繪制）、免疫學(xué)（免疫細(xì)胞在體三維追蹤）、藥物篩選（長時(shí)程藥效評估）等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。這項(xiàng)源自中國的原創(chuàng)技術(shù)，不僅推動(dòng)了光學(xué)顯微成像領(lǐng)域的進(jìn)步，更將為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究帶來革命性的觀測工具，助力人類更深入地解碼生命的立體奧秘。

一面鏡子，照見生命最深處的奧秘；一項(xiàng)創(chuàng)新，打開微觀世界的新窗口。這項(xiàng)源自中國的技術(shù)突破，正引領(lǐng)全球生物成像進(jìn)入三維超清時(shí)代。

顯微鏡前的你，準(zhǔn)備好迎接這場分辨率革命了嗎？

DOI:10.1038/s41377-021-00665-9.