I. 目的

本實(shí)驗(yàn)方案的目的是描述如何在1 / 4體積反應(yīng)中，使用MANTIS在96孔板上制備和組合試劑，以構(gòu)建高通量SMART-Seq v4 cDNA文庫(kù)。

II. 注意事項(xiàng)

1. 下面指定的試劑體積是使用SMART-Seq v4 Ultra低輸入RNA試劑盒按照本方案進(jìn)行測(cè)序時(shí)精確計(jì)算得出的，該試劑盒用于測(cè)序，可在三塊孔板上進(jìn)行96次反應(yīng)，每塊板四分之一體積試劑，使用單一的96反應(yīng)試劑盒(634891。為了確保試劑有足夠的數(shù)量進(jìn)行3x96個(gè)1/4體積反應(yīng)，請(qǐng)務(wù)必遵守LV、HV芯片的灌注和預(yù)分配體積:

• LV芯片灌注體積= 5.4 μl 

• LV芯片預(yù)分配體積為=1.2 μl 

• HV芯片灌注體積=12 μl 

• HV芯片預(yù)分配體積=5 μl

1. 每一個(gè)新的添加物使用一個(gè)新的芯片。在一天運(yùn)行結(jié)束后，按照相應(yīng)的洗滌步驟清洗所有LV和HV芯片。

2. 注意避免在整個(gè)過(guò)程中出現(xiàn)氣泡。

3. 有關(guān)SMART-Seq v4 Ultra低輸入RNA試劑盒測(cè)序的更多信息，請(qǐng)參考試劑盒用戶手冊(cè)，可在takarabio. com/manuals獲得。

III. 實(shí)驗(yàn)方案

A.反應(yīng)緩沖液的制備

1. 使用1.5 ml微量離心管，手動(dòng)分配31μl的10X裂解液。加入RNAse抑制劑1.6μl，核酸酶游離水46.5μl。然后用旋渦輕輕混合，快速旋轉(zhuǎn)試劑。

B. 樣品的制備

1.在不含Mg2 +和Ca2 +離子的PBS中洗滌細(xì)胞，然后將細(xì)胞分配或分選到96-孔板的各個(gè)孔中，使每個(gè)細(xì)胞懸浮于2μl不含Ca2 + / Mg2 +的PBS中（更小的懸浮體積也在接受范圍內(nèi)，參閱步驟3）。

2.在200ul移液器吸頭中裝入72.75ul反應(yīng)緩沖液，然后將吸頭裝到LV Mantis芯片上（位置1）。對(duì)MANTIS進(jìn)行編程，以從所選位置添加0.6 μl反應(yīng)緩沖液。

3.可選：如果步驟1中每個(gè)單細(xì)胞懸浮液的體積小于2 ul，則用200μl無(wú)核酸酶水填充200μl移液器吸頭，并將吸頭裝到Mantis LV芯片上（位置6）。對(duì)MANTIS進(jìn)行編程，以從選定位置添加足夠量的無(wú)核酸酶水，以使每個(gè)孔的總流體量達(dá)到2 μl。對(duì)于陰性對(duì)照樣品，在空的孔中加入2μl無(wú)核酸酶的水。

4.在200ul 移液器吸頭中裝入60ul 3'SMART CDS Primer IIA，然后裝到LV Mantis芯片上（位置2）。對(duì)MANTIS進(jìn)行編程，以從所選位置添加0.5μl 3'SMART CDS Primer IIA（12μM）。

5. 用封口膠帶密封孔板，收集試劑，輕輕旋轉(zhuǎn)3-5次孔板。以每分鐘2000轉(zhuǎn)的速度旋轉(zhuǎn)孔板30-60秒。

C.低聚糖退火

1.將孔板從B部分轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的熱循環(huán)器中，并在72度下孵育3分鐘。

2. 孵化3分鐘后，放置到冰塊上2分鐘。

3. 當(dāng)孔板放在冰上時(shí)，準(zhǔn)備RT反應(yīng)混合液(下方D部分)。

D.RT反應(yīng)混合液的制備

1. 將下列試劑按如下順序室溫添加到1.5 ml無(wú)核酸酶管中，務(wù)必在使用前最后添加SMARTScribe?II逆轉(zhuǎn)錄酶。上下輕輕混合。為了生成足夠96次反應(yīng)的主混合物，使用多10％體積的試劑，以及10uL灌注體積 進(jìn)行溢出反應(yīng)。

2.在2,000μl的移液管吸頭中加入208 ul的RT反應(yīng)混合液，裝到LV MANTIS芯片上(位置3)。用MANTIS液處理器編程，將1.9μl的RT反應(yīng)混合液加入到選擇的孔中。

3. 用封口膠帶密封孔板，收集試劑，輕輕旋轉(zhuǎn)3-5次孔板。以每分鐘2000轉(zhuǎn)的速度旋轉(zhuǎn)孔板30-60秒。

E.第一鏈的合成

1. 將孔板從D部分轉(zhuǎn)移到一個(gè)預(yù)熱的熱循環(huán)器中，并運(yùn)行以下程序 :

F.PCR擴(kuò)增cDNA

1.將下列試劑在1.5uL管中冰上混合。務(wù)必在使用前最后添加SeqAmp?DNA聚合酶。上下吹打輕輕混合。上下輕輕混合。為了生成足夠96次反應(yīng)的主混合物，使用足夠進(jìn)行12個(gè)溢出反應(yīng)的試劑量（即總共108個(gè)反應(yīng)）。

2.在1,000 ul的移液管吸頭中加入810 ul的RT反應(yīng)混合液，裝到MANTIS芯片上(位置3)。用MANTIS液處理器編程，將7.5 μl的RT反應(yīng)混合液從選擇的位置加入到96孔中。

3. 用封口膠帶密封孔板，收集試劑，輕輕旋轉(zhuǎn)3-5次孔板。以每分鐘2000轉(zhuǎn)的速度旋轉(zhuǎn)孔板30-60秒。

4. 將孔板轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的熱循環(huán)器中，然后運(yùn)行以下程序：

*使用以下表格作為指導(dǎo)，以幫助確定輸入的最佳PCR循環(huán)次數(shù):

5. PCR反應(yīng)完成后，在200μl移液管吸頭中加入60μl的10X裂解緩沖液，并將吸頭裝到LV Mantis芯片上（位置1）。用MANTIS液處理器編程，將0.3 μl的10X裂解緩沖液加入到選擇的孔中。

6.如下一階段(階段G)所示，可以使用SPRI beads磁珠手工純化cDNA。

G.用Agencourt AMPure XP試劑盒純化擴(kuò)增的cDNA

1. 每次使用前，取磁珠等分液置于室溫下至少30分鐘，攪拌均勻即可。

2. 每次實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備新鮮的80%乙醇。每個(gè)樣品需要100 μl。

3. 需要一個(gè)能容納96孔板的磁力分離架。

4. 旋轉(zhuǎn)AMPure XP磁珠混合均勻，然后在每個(gè)樣品中加13 μl。

5. 通過(guò)輕輕旋轉(zhuǎn)或上下?lián)u晃移液至少10次，徹底混合。

6. 室溫孵化8分鐘，讓cDNA與磁珠結(jié)合。

7. 輕輕地旋轉(zhuǎn)樣品，從樣品孔的側(cè)面收集液體。將樣品放在磁力分離架上約5分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，直至液體完全清澈，上清液中無(wú)磁珠殘留。

8. 當(dāng)樣品放在磁力分離架上時(shí)，用移液管移去上清液并丟棄。

9.把樣品放在磁力分離架上。每個(gè)樣品添加50μl新鮮配制的80%乙醇，不干擾磁珠。等待30秒后，小心移去含有污染物的上清液。在清洗過(guò)程中， cDNA將繼續(xù)結(jié)合在磁珠上。

10. 重復(fù)乙醇清洗(步驟9)一次。

11. 輕輕地旋轉(zhuǎn)樣品，從樣品孔的側(cè)面收集液體。將樣品放在磁力分離架上30秒，然后用吸管除去所有剩余的乙醇。

12. 在室溫下放置樣品約2-2.5分鐘，直到顆粒不再有光澤，但在裂紋出現(xiàn)之前。

13. 待磁珠干燥后，加17μl的洗脫緩沖液蓋住磁珠。從磁力分離架中取出樣品，徹底混合，重新懸浮磁珠。

14. 室溫孵化2分鐘以補(bǔ)水。

15. 輕地旋轉(zhuǎn)樣品，從樣品孔的側(cè)面收集液體。將樣品放在磁力分離架上約1分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，直至液體完全清澈。

16. 含有純化cDNA的上清液從每個(gè)孔轉(zhuǎn)移到無(wú)核酸酶，低粘附力的管中。在每個(gè)試管上貼上樣品信息標(biāo)簽，并在-20°C保存。