細(xì)胞鐵死亡常用抑制劑、誘導(dǎo)劑及檢測方法和應(yīng)用案例_abio生物試劑品牌網(wǎng)
鐵死亡作為程序性細(xì)胞死亡的一種，自2012年被Dixon等人提出以來[1]，相關(guān)研究呈指數(shù)級增長。最近，一項發(fā)表在《Nature》雜志上的文章再次吸引了大家的目光，它揭示了溶酶體鐵在鐵死亡中的關(guān)鍵作用，并成功開發(fā)出一種名為Fento-1的小分子化合物，用于激活溶酶體鐵并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的鐵死亡[2]?？梢婅F死亡在未來很長一段時間都是生命科學(xué)領(lǐng)域中的熱門話題，AbMole為準(zhǔn)備開展鐵死亡研究的同學(xué)詳細(xì)講述與之相關(guān)的調(diào)節(jié)劑和檢測手段。
AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細(xì)胞因子、人源單抗、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽、靶點蛋白、化合物庫、抗生素等科研試劑，全球大量文獻(xiàn)專利引用。
一、鐵死亡的調(diào)節(jié)劑
1. 鐵死亡抑制劑：給細(xì)胞鐵死亡按下“暫停鍵”
（1）Ferrostatin-1 (Fer-1)
Ferrostatin-1（Fer-1，AbMole，M2698）是鐵死亡研究中的“明星”抑制劑。它主要通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)來發(fā)揮作用。細(xì)胞鐵死亡過程中會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），這些活性氧會攻擊細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸 (PUFAs)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而Fer-1能夠有效阻斷這一過程，就像給細(xì)胞的死亡之路設(shè)置了一道堅固的屏障。它通過與細(xì)胞膜上的特定成分結(jié)合，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成。在實驗中，如出現(xiàn)加入Fer-1后細(xì)胞活力恢復(fù)、脂質(zhì)過氧化減少等結(jié)果，可說明該研究中存在細(xì)胞的鐵死亡。
案例詳解
上海交通大學(xué)的科研人員使用了AbMole提供的 Fer-1處理293T、T24、5637等細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Fer-1可抑制Hedyotis diffusa Willd (HDW) 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，表明HDW可引起上述細(xì)胞的鐵死亡（圖1）。
圖 1. HDW、Fer-1和HDW + Fer-1 處理24 h后，用 cck-8 法檢測 293T、T24和5637 細(xì)胞的存活率[3]。
（2）鐵離子螯合劑
DFO（Deferoxamine，去鐵胺，AbMole，M5558）是一種鐵螯合劑，在鐵死亡的抑制中也有獨特的作用。鐵死亡的關(guān)鍵因素之一是細(xì)胞內(nèi)鐵離子的過量積累，這些鐵離子參與芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基，推動細(xì)胞走向死亡。DFO能夠與細(xì)胞內(nèi)的鐵離子結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而減少細(xì)胞內(nèi)可利用的鐵離子數(shù)量，進(jìn)而抑制自由基的產(chǎn)生和鐵死亡的發(fā)生。特別是在一些涉及鐵過載誘導(dǎo)的鐵死亡模型中，DFO的加入可以使細(xì)胞存活率明顯提高。 Deferiprone（DFP，去鐵酮，AbMole，M2617）則是另一種鐵離子螯合劑，對鐵離子也具有很好的親和性，可有效抑制鐵死亡。 Ciclopirox olamine（CPX，AbMole，M3593）是一種抗真菌劑，同時也是一種鐵離子螯合劑和鐵死亡抑制劑。
范例詳解：
Mol Cell. 2024 Oct 17;84(20):4016-4030.e6.
廈門大學(xué)細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國家重點實驗室的科研人員為研究H2S對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的影響，使用了AbMole的 DFO和 Fer-1處理H1299和A549等細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)GYY 4137（H2S供體）對上述兩種細(xì)胞的抑制活性可被DFO、Fer-1等鐵死亡抑制劑阻斷，且脂質(zhì)活性氧的水平也有所降低，這些變化沒有出現(xiàn)在凋亡和壞死抑制劑處理組中，證實H2S可引起非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的鐵死亡（圖2）。
圖 2. 通過CCK-8實驗和流式細(xì)胞術(shù)分析檢測Fer-1、DFO、ZVAD-FMK、3-MA、VX765 或 Nec1s 對 GYY 4137處理的H1299 和 A549 細(xì)胞的活力和脂質(zhì)過氧化的影響[4]。
（3）ROS清除劑
ROS是鐵死亡的主要驅(qū)動者，一些具有還原性質(zhì)的化合物可以幫助細(xì)胞應(yīng)對氧化應(yīng)激，逃逸鐵死亡。例如 N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，Acetylcysteine，AbMole，M5385）是一款經(jīng)典的ROS清除劑，可有效抑制鐵死亡。除此之外， Liproxstatin-1（AbMole，M8531）也可以清除ROS，激活Nrf2通路并恢復(fù)GPX4（鐵死亡負(fù)調(diào)控蛋白）的水平； Trolox（AbMole，M7434）則是一種維生素 E 的類似物，具有強大的抗氧化和鐵死亡抑制作用。
范例詳解：
Acta Pharm Sin B. 2022 May;12(5):2300-2314.
中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所在上述文章中研究了Celastrol（雷公藤紅素）在改善肝纖維化中的作用及其分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)， Celastrolhttps通過促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生和誘導(dǎo)鐵死亡（ferroptosis）來發(fā)揮抗纖維化作用。在實驗中，科研人員使用了由AbMole提供的 N-乙酰半胱氨酸（NAC，Acetylcysteine，AbMole，M5385）作為鐵死亡抑制劑，以驗證鐵死亡是Celastrol（雷公藤紅素）抗纖維化的核心機(jī)制。
圖 3. Celastrol exerts anti-fibrosis effect by inducing ferroptosis in activated-HSCs[5]
2. 鐵死亡激動劑：開啟細(xì)胞死亡的“加速器”
(1) 靶向GPX4的鐵死亡誘導(dǎo)劑
谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）是細(xì)胞清除脂質(zhì)活性氧，中斷細(xì)胞膜過氧化的關(guān)鍵蛋白。 RSL3（AbMole，M9060）是一種小分子化合物，它是鐵死亡的典型激動劑。它主要通過干擾胞內(nèi)GPX4的功能來發(fā)揮作用，使得細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)出現(xiàn)“漏洞”。之后細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)就會失控，大量有害的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物積累，最終導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡。在實驗中，當(dāng)向細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入RSL3后，細(xì)胞膜完整性遭到破壞，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)鐵死亡的典型特征，如細(xì)胞萎縮、線粒體損傷等。RSL3常用于鐵死亡的誘導(dǎo)或作為鐵死亡研究中的陽性對照。除了RSL3以外， FIN56（AbMole，M6731）、 ML162（AbMole，M10587）、 ML210（AbMole，M8380）等也是經(jīng)典的GPX4抑制劑，可引起多種細(xì)胞的鐵死亡。
范例詳解：
首都醫(yī)科大學(xué)的研究者們?yōu)檠芯縉rf 2和鐵死亡分別在急性肝衰竭（ACLF）中起到的作用，使用了AbMole的 RSL-3（鐵死亡誘導(dǎo)劑） 、 ML 385（Nrf 2 抑制劑）、 Fer-1（鐵死亡抑制劑），發(fā)現(xiàn)RSL-3和Fer-1分別通過誘導(dǎo)或抑制鐵死亡進(jìn)而加重或減緩ACLF（圖3）[6]。
圖4. RSL-3和Fer-1對ACLF小鼠肝臟的影響[6]。
(2) 抑制GSH合成
谷胱甘肽（GSH）在鐵死亡中起著關(guān)鍵的保護(hù)作用，它既可以清除ROS，也可以作為GPX4的重要輔助因子。 Erastin是一種常用的鐵死亡激動劑。Erastin通過抑制System Xc?來誘導(dǎo)鐵死亡。System Xc?是一個由SLC7A11和SLC3A2組成的胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)胱氨酸的攝取和GSH的合成。 Erastin的這種作用機(jī)制為研究細(xì)胞氨基酸代謝與鐵死亡之間的關(guān)系提供了一個很好的切入點。Erastin也能夠通過抑制Nrf2的活性來降低GSH水平，進(jìn)而抑制GPX4的活性[7]。 L-Buthionine-sulfoximine（AbMole，BSO，M3865）則是一種不可逆的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）抑制劑，通過減少GSH的合成來誘導(dǎo)鐵死亡。
范例詳解：
Cell metabolism 37(1) (2025) 169-186.e9.
首都醫(yī)科大學(xué)的實驗人員為研究 lysophosphatidylcholines（LPC）對鐵死亡的調(diào)節(jié)，及其在阿爾茨海默癥（AD）中的作用，使用了AbMole的鐵死亡誘導(dǎo)劑 Erastin和RSL3（https://www.abmole.cn/products/rsl3.html），結(jié)果表明LPC可抑制兩種誘導(dǎo)劑引起的HT22細(xì)胞鐵死亡（圖5）。
圖 5. HT22細(xì)胞分別經(jīng)RSL3、LPC、Erastin、Lip-1處理后的細(xì)胞活力[8]。
（3）其他
iFSP1（AbMole，M11314）是一種有效的、選擇性鐵死亡誘導(dǎo)劑，iFSP1通過抑制FSP1（鐵死亡抑制蛋白1，也稱AIFM2）的抗氧化活性，來誘導(dǎo)鐵死亡。 青蒿素（Artemisinine）（AbMole，M4382）及其衍生物，如 Dihydroartemisinin（雙氫青蒿素，AbMole，M4991）、 Artesunate（青蒿琥酯，AbMole，M1293）等也也具有鐵死亡誘導(dǎo)能力，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中的過氧橋鍵在與鐵離子發(fā)生反應(yīng)后會斷裂并產(chǎn)生大量自由基可以攻擊細(xì)胞膜。 2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國家心血管研究中心和美國哥倫比亞大學(xué)用于動物體內(nèi)實驗，相關(guān)科研成果發(fā)表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。
二、鐵死亡的檢測方法
1. 細(xì)胞活力檢測
細(xì)胞活力檢測是評估鐵死亡的重要手段，MTT法、CCK-8法和基于ATP的細(xì)胞活力檢測法是當(dāng)下檢測細(xì)胞活力的主流方法。例如可通過在實驗組中額外添加鐵死亡抑制劑，觀察細(xì)活力的變化，如果細(xì)胞活力有所恢復(fù)，則可說明鐵死亡是上述細(xì)胞死亡的原因之一。
MTT （AbMole，M7007）的原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。通過加入二甲基亞砜（DMSO）溶解甲瓚，并使用酶標(biāo)儀測定在特定波長下的吸光度值，即可檢測出活細(xì)胞的數(shù)量。
CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒的原理與 MTT 法類似，其核心成分WST-8可被細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原為水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物。該產(chǎn)物生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過酶標(biāo)儀測定吸光度值即可反映細(xì)胞活力。相較于 MTT 法，CCK-8法靈敏度更高，檢測時間有所縮短，步驟較少。此外，AbMole的 CCK-8檢測試劑盒（AbMole，M4839）還具有無污染、不易掛壁、長期儲存不易變色等多種優(yōu)點。
基于ATP的檢測是一種新型的細(xì)胞活力測定方法。ATP 是細(xì)胞內(nèi)主要的能量單位，細(xì)胞代謝活動越旺盛，ATP生成量越多。該檢測方法利用熒光素-熒光素酶系統(tǒng)，熒光素酶在 ATP 存在的情況下，催化熒光素氧化發(fā)光，所產(chǎn)生的光信號強度與 ATP 含量呈線性關(guān)系，通過檢測發(fā)光強度即可準(zhǔn)確量化細(xì)胞內(nèi) ATP水平，進(jìn)而分析細(xì)胞活力。AbMole的 增強型ATP細(xì)胞活力檢測試劑盒（AbMole，M55403）具有靈敏度更高，更適合少量細(xì)胞檢測、更少受試劑氧化還原影響、孵育時間更短等優(yōu)勢，是鐵死亡研究的強大工具。
圖 6. 增強型ATP細(xì)胞活力檢測試劑盒的工作原理
除了細(xì)胞活力的檢測，Calcein-AM/PI活死細(xì)胞雙染試劑盒（AbMole，M55257） Calcein-AM/PI也是一種研究鐵死亡常用的檢測工具，通過Calcein-AM和PI對活細(xì)胞和死細(xì)胞分別進(jìn)行染色標(biāo)記，結(jié)合熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)等檢測方法可以有效定性或者量化不同處理組種死亡細(xì)胞的比例，再結(jié)合其他表征手段確定鐵死亡的存在。
范例詳解：
Cell Death Dis. 2025 Apr 7;16(1):261.
南昌大學(xué)、江西省人民醫(yī)院研究了SIRT5（Sirtuin 5）在膠質(zhì)瘤中的作用及其機(jī)制。結(jié)果表明SIRT5在膠質(zhì)瘤中通過穩(wěn)定BCAT1，促進(jìn)支鏈氨基酸代謝，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和對鐵死亡的耐受性。AbMole的 CCK-8試劑盒（AbMole，M4839）被用于評估鐵死亡誘導(dǎo)劑對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性，以及SIRT5對這種毒性的調(diào)節(jié)作用。
圖 7. The IC50 values of SAS in U251 and U87 cells were determined by CCK8 assay following SIRT5 knockdown or SIRT5 overexpression[9]
2. 鐵代謝檢測
鐵死亡的發(fā)生依賴于細(xì)胞內(nèi)鐵離子的積累，雖然質(zhì)譜法可以定量鐵離子的水平，但是難以實時觀測鐵離子的動態(tài)變化。因此，熒光法是研究鐵死亡過程中鐵離子變化的主流方法，其中最常使用的染料是 FeRhoNox-1（Fe2+ indicator，AbMole，M21552），其在結(jié)合鐵離子后會發(fā)出橙色熒光（EX/EM = 540/575 nm）。此外，還可以對細(xì)胞內(nèi)的鐵蛋白等鐵死亡重要靶點進(jìn)行WB實驗以分析其變化。
3. 脂質(zhì)過氧化檢測
脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的關(guān)鍵特征，檢測脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物是判斷鐵死亡發(fā)生的重要依據(jù)?？捎脽晒馓结槞z測出脂質(zhì)過氧化的水平，如 ABDP 581/591 C11（AbMoel，M29325），該探針在正常脂質(zhì)環(huán)境下呈紅色熒光，當(dāng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化時，其熒光顏色會轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，通過熒光顏色和強度的變化可以直觀地檢測脂質(zhì)過氧化的發(fā)生和程度。
4-Hydroxynonenal（4-HNE，4-羥基壬烯醛，M14296）也是PUFA過氧化的重要產(chǎn)物之一，4-HNE能夠與DNA和蛋白質(zhì)中的多種親核位點發(fā)生反應(yīng)，形成各種加合物。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）可以定量分析鐵死亡過程中產(chǎn)生的4-HNE-蛋白質(zhì)加合物。此外，蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）和免疫熒光利用4-HNE特異性的抗體，也可以實現(xiàn)對4-HNE蛋白質(zhì)加合物的量化或定性分析。
范例詳解：
中科院電工研究所的科研人員使用了AbMole的 ABDP 581/591 C11（AbMoel，M29325）處理TIF（TRPV1-鐵蛋白）過表達(dá)的HEK293T細(xì)胞，以檢測磁熱造成的細(xì)胞氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化。
圖 8. 在 TIF 過表達(dá)的 HEK293T 細(xì)胞中，AMF 處理期間發(fā)生脂質(zhì)過氧化[10]。
4. ROS檢測
如前所述ROS是鐵死亡的主要驅(qū)動力，因此其水平的變化可間接反映鐵死亡的發(fā)生。目前ROS的檢測方法主要是采用熒光探針法， H2DCFDA（AbMole，M9096）是一種常用的細(xì)胞滲透性熒光探針。它本身無熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解生成DCFH，DCFH不能通過細(xì)胞膜，會積聚在細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的ROS能夠氧化DCFH生成有熒光的DCF（可用FITC通道直接觀察），其熒光強度與ROS水平成正比。DHE（Dihydroethidium， 二氫乙錠，AbMole，M9696）則是另一種ROS探針，側(cè)重于檢測超氧陰離子。
范例詳解：
Sci Adv. 2024 Aug 16;10(33):eado7249.
蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的實驗人員在上述文章設(shè)計了一種磁性水凝膠（FDA-TA），它能通過調(diào)節(jié)鐵代謝來修復(fù)組織，特別是在椎間盤退行性變（IVDD）中抑制鐵死亡。來自AbMole的 H2DCFDA（AbMole，M9096）和 JC-1試劑盒（AbMole，M10454），分別被用于檢測大鼠椎間盤的髓核細(xì)胞（nucleus pulposus cells, NPCs）中ROS和線粒體膜電位的變化。
圖 9. JC-1染色后的熒光顯微圖像和H2DCFDA的流式量化分析[11]
5. GSH檢測
GSH是鐵死亡過程中的抗氧化劑，GSH在清除ROS以及參與GPX4對脂質(zhì)過氧化物的還原后會被轉(zhuǎn)化為GSSG，因此GSH是衡量鐵死亡的另一個重要標(biāo)準(zhǔn)。 Monochlorobimane（AbMole，M55675）是一種熒光染料，可用于測定細(xì)胞中GSH（EX/Em = 380/470 nm）。此外， DTNB（AbMole，M11509）可通過 DTNB 與 GSH 反應(yīng)生成黃色復(fù)合物，在412nm處測吸光度可計算 GSH 含量。
6. 形態(tài)學(xué)觀測
生物電鏡技術(shù)可直接對細(xì)胞和線粒體的形態(tài)進(jìn)行觀測。線粒體是鐵死亡過程中最顯著的超微結(jié)構(gòu)變化部位。細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時，線粒體會出現(xiàn)收縮變小、膜密度增高，嵴減少甚至消失。此外，細(xì)胞膜的完整性可能也會受到破壞，出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象。
AbMole是ChemBridge中國區(qū)官方指定合作伙伴。
參考文獻(xiàn)及鳴謝
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一、鐵死亡的調(diào)節(jié)劑
1. 鐵死亡抑制劑：給細(xì)胞鐵死亡按下“暫停鍵”
（1）Ferrostatin-1 (Fer-1)
Ferrostatin-1（Fer-1，AbMole，M2698）是鐵死亡研究中的“明星”抑制劑。它主要通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)來發(fā)揮作用。細(xì)胞鐵死亡過程中會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），這些活性氧會攻擊細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸 (PUFAs)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而Fer-1能夠有效阻斷這一過程，就像給細(xì)胞的死亡之路設(shè)置了一道堅固的屏障。它通過與細(xì)胞膜上的特定成分結(jié)合，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成。在實驗中，如出現(xiàn)加入Fer-1后細(xì)胞活力恢復(fù)、脂質(zhì)過氧化減少等結(jié)果，可說明該研究中存在細(xì)胞的鐵死亡。
案例詳解
上海交通大學(xué)的科研人員使用了AbMole提供的 Fer-1處理293T、T24、5637等細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Fer-1可抑制Hedyotis diffusa Willd (HDW) 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，表明HDW可引起上述細(xì)胞的鐵死亡（圖1）。
圖 1. HDW、Fer-1和HDW + Fer-1 處理24 h后，用 cck-8 法檢測 293T、T24和5637 細(xì)胞的存活率[3]。
（2）鐵離子螯合劑
DFO（Deferoxamine，去鐵胺，AbMole，M5558）是一種鐵螯合劑，在鐵死亡的抑制中也有獨特的作用。鐵死亡的關(guān)鍵因素之一是細(xì)胞內(nèi)鐵離子的過量積累，這些鐵離子參與芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基，推動細(xì)胞走向死亡。DFO能夠與細(xì)胞內(nèi)的鐵離子結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而減少細(xì)胞內(nèi)可利用的鐵離子數(shù)量，進(jìn)而抑制自由基的產(chǎn)生和鐵死亡的發(fā)生。特別是在一些涉及鐵過載誘導(dǎo)的鐵死亡模型中，DFO的加入可以使細(xì)胞存活率明顯提高。 Deferiprone（DFP，去鐵酮，AbMole，M2617）則是另一種鐵離子螯合劑，對鐵離子也具有很好的親和性，可有效抑制鐵死亡。 Ciclopirox olamine（CPX，AbMole，M3593）是一種抗真菌劑，同時也是一種鐵離子螯合劑和鐵死亡抑制劑。
范例詳解：
Mol Cell. 2024 Oct 17;84(20):4016-4030.e6.
廈門大學(xué)細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國家重點實驗室的科研人員為研究H2S對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的影響，使用了AbMole的 DFO和 Fer-1處理H1299和A549等細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)GYY 4137（H2S供體）對上述兩種細(xì)胞的抑制活性可被DFO、Fer-1等鐵死亡抑制劑阻斷，且脂質(zhì)活性氧的水平也有所降低，這些變化沒有出現(xiàn)在凋亡和壞死抑制劑處理組中，證實H2S可引起非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的鐵死亡（圖2）。
圖 2. 通過CCK-8實驗和流式細(xì)胞術(shù)分析檢測Fer-1、DFO、ZVAD-FMK、3-MA、VX765 或 Nec1s 對 GYY 4137處理的H1299 和 A549 細(xì)胞的活力和脂質(zhì)過氧化的影響[4]。
（3）ROS清除劑
ROS是鐵死亡的主要驅(qū)動者，一些具有還原性質(zhì)的化合物可以幫助細(xì)胞應(yīng)對氧化應(yīng)激，逃逸鐵死亡。例如 N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，Acetylcysteine，AbMole，M5385）是一款經(jīng)典的ROS清除劑，可有效抑制鐵死亡。除此之外， Liproxstatin-1（AbMole，M8531）也可以清除ROS，激活Nrf2通路并恢復(fù)GPX4（鐵死亡負(fù)調(diào)控蛋白）的水平； Trolox（AbMole，M7434）則是一種維生素 E 的類似物，具有強大的抗氧化和鐵死亡抑制作用。
范例詳解：
Acta Pharm Sin B. 2022 May;12(5):2300-2314.
中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所在上述文章中研究了Celastrol（雷公藤紅素）在改善肝纖維化中的作用及其分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)， Celastrolhttps通過促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生和誘導(dǎo)鐵死亡（ferroptosis）來發(fā)揮抗纖維化作用。在實驗中，科研人員使用了由AbMole提供的 N-乙酰半胱氨酸（NAC，Acetylcysteine，AbMole，M5385）作為鐵死亡抑制劑，以驗證鐵死亡是Celastrol（雷公藤紅素）抗纖維化的核心機(jī)制。
圖 3. Celastrol exerts anti-fibrosis effect by inducing ferroptosis in activated-HSCs[5]
2. 鐵死亡激動劑：開啟細(xì)胞死亡的“加速器”
(1) 靶向GPX4的鐵死亡誘導(dǎo)劑
谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）是細(xì)胞清除脂質(zhì)活性氧，中斷細(xì)胞膜過氧化的關(guān)鍵蛋白。 RSL3（AbMole，M9060）是一種小分子化合物，它是鐵死亡的典型激動劑。它主要通過干擾胞內(nèi)GPX4的功能來發(fā)揮作用，使得細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)出現(xiàn)“漏洞”。之后細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)就會失控，大量有害的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物積累，最終導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡。在實驗中，當(dāng)向細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入RSL3后，細(xì)胞膜完整性遭到破壞，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)鐵死亡的典型特征，如細(xì)胞萎縮、線粒體損傷等。RSL3常用于鐵死亡的誘導(dǎo)或作為鐵死亡研究中的陽性對照。除了RSL3以外， FIN56（AbMole，M6731）、 ML162（AbMole，M10587）、 ML210（AbMole，M8380）等也是經(jīng)典的GPX4抑制劑，可引起多種細(xì)胞的鐵死亡。
范例詳解：
首都醫(yī)科大學(xué)的研究者們?yōu)檠芯縉rf 2和鐵死亡分別在急性肝衰竭（ACLF）中起到的作用，使用了AbMole的 RSL-3（鐵死亡誘導(dǎo)劑） 、 ML 385（Nrf 2 抑制劑）、 Fer-1（鐵死亡抑制劑），發(fā)現(xiàn)RSL-3和Fer-1分別通過誘導(dǎo)或抑制鐵死亡進(jìn)而加重或減緩ACLF（圖3）[6]。
圖4. RSL-3和Fer-1對ACLF小鼠肝臟的影響[6]。
(2) 抑制GSH合成
谷胱甘肽（GSH）在鐵死亡中起著關(guān)鍵的保護(hù)作用，它既可以清除ROS，也可以作為GPX4的重要輔助因子。 Erastin是一種常用的鐵死亡激動劑。Erastin通過抑制System Xc?來誘導(dǎo)鐵死亡。System Xc?是一個由SLC7A11和SLC3A2組成的胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)胱氨酸的攝取和GSH的合成。 Erastin的這種作用機(jī)制為研究細(xì)胞氨基酸代謝與鐵死亡之間的關(guān)系提供了一個很好的切入點。Erastin也能夠通過抑制Nrf2的活性來降低GSH水平，進(jìn)而抑制GPX4的活性[7]。 L-Buthionine-sulfoximine（AbMole，BSO，M3865）則是一種不可逆的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）抑制劑，通過減少GSH的合成來誘導(dǎo)鐵死亡。
范例詳解：
Cell metabolism 37(1) (2025) 169-186.e9.
首都醫(yī)科大學(xué)的實驗人員為研究 lysophosphatidylcholines（LPC）對鐵死亡的調(diào)節(jié)，及其在阿爾茨海默癥（AD）中的作用，使用了AbMole的鐵死亡誘導(dǎo)劑 Erastin和RSL3（https://www.abmole.cn/products/rsl3.html），結(jié)果表明LPC可抑制兩種誘導(dǎo)劑引起的HT22細(xì)胞鐵死亡（圖5）。
圖 5. HT22細(xì)胞分別經(jīng)RSL3、LPC、Erastin、Lip-1處理后的細(xì)胞活力[8]。
（3）其他
iFSP1（AbMole，M11314）是一種有效的、選擇性鐵死亡誘導(dǎo)劑，iFSP1通過抑制FSP1（鐵死亡抑制蛋白1，也稱AIFM2）的抗氧化活性，來誘導(dǎo)鐵死亡。 青蒿素（Artemisinine）（AbMole，M4382）及其衍生物，如 Dihydroartemisinin（雙氫青蒿素，AbMole，M4991）、 Artesunate（青蒿琥酯，AbMole，M1293）等也也具有鐵死亡誘導(dǎo)能力，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中的過氧橋鍵在與鐵離子發(fā)生反應(yīng)后會斷裂并產(chǎn)生大量自由基可以攻擊細(xì)胞膜。 2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國家心血管研究中心和美國哥倫比亞大學(xué)用于動物體內(nèi)實驗，相關(guān)科研成果發(fā)表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。
二、鐵死亡的檢測方法
1. 細(xì)胞活力檢測
細(xì)胞活力檢測是評估鐵死亡的重要手段，MTT法、CCK-8法和基于ATP的細(xì)胞活力檢測法是當(dāng)下檢測細(xì)胞活力的主流方法。例如可通過在實驗組中額外添加鐵死亡抑制劑，觀察細(xì)活力的變化，如果細(xì)胞活力有所恢復(fù)，則可說明鐵死亡是上述細(xì)胞死亡的原因之一。
MTT （AbMole，M7007）的原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。通過加入二甲基亞砜（DMSO）溶解甲瓚，并使用酶標(biāo)儀測定在特定波長下的吸光度值，即可檢測出活細(xì)胞的數(shù)量。
CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒的原理與 MTT 法類似，其核心成分WST-8可被細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原為水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物。該產(chǎn)物生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過酶標(biāo)儀測定吸光度值即可反映細(xì)胞活力。相較于 MTT 法，CCK-8法靈敏度更高，檢測時間有所縮短，步驟較少。此外，AbMole的 CCK-8檢測試劑盒（AbMole，M4839）還具有無污染、不易掛壁、長期儲存不易變色等多種優(yōu)點。
基于ATP的檢測是一種新型的細(xì)胞活力測定方法。ATP 是細(xì)胞內(nèi)主要的能量單位，細(xì)胞代謝活動越旺盛，ATP生成量越多。該檢測方法利用熒光素-熒光素酶系統(tǒng)，熒光素酶在 ATP 存在的情況下，催化熒光素氧化發(fā)光，所產(chǎn)生的光信號強度與 ATP 含量呈線性關(guān)系，通過檢測發(fā)光強度即可準(zhǔn)確量化細(xì)胞內(nèi) ATP水平，進(jìn)而分析細(xì)胞活力。AbMole的 增強型ATP細(xì)胞活力檢測試劑盒（AbMole，M55403）具有靈敏度更高，更適合少量細(xì)胞檢測、更少受試劑氧化還原影響、孵育時間更短等優(yōu)勢，是鐵死亡研究的強大工具。
圖 6. 增強型ATP細(xì)胞活力檢測試劑盒的工作原理
除了細(xì)胞活力的檢測，Calcein-AM/PI活死細(xì)胞雙染試劑盒（AbMole，M55257） Calcein-AM/PI也是一種研究鐵死亡常用的檢測工具，通過Calcein-AM和PI對活細(xì)胞和死細(xì)胞分別進(jìn)行染色標(biāo)記，結(jié)合熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)等檢測方法可以有效定性或者量化不同處理組種死亡細(xì)胞的比例，再結(jié)合其他表征手段確定鐵死亡的存在。
范例詳解：
Cell Death Dis. 2025 Apr 7;16(1):261.
南昌大學(xué)、江西省人民醫(yī)院研究了SIRT5（Sirtuin 5）在膠質(zhì)瘤中的作用及其機(jī)制。結(jié)果表明SIRT5在膠質(zhì)瘤中通過穩(wěn)定BCAT1，促進(jìn)支鏈氨基酸代謝，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和對鐵死亡的耐受性。AbMole的 CCK-8試劑盒（AbMole，M4839）被用于評估鐵死亡誘導(dǎo)劑對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性，以及SIRT5對這種毒性的調(diào)節(jié)作用。
圖 7. The IC50 values of SAS in U251 and U87 cells were determined by CCK8 assay following SIRT5 knockdown or SIRT5 overexpression[9]
2. 鐵代謝檢測
鐵死亡的發(fā)生依賴于細(xì)胞內(nèi)鐵離子的積累，雖然質(zhì)譜法可以定量鐵離子的水平，但是難以實時觀測鐵離子的動態(tài)變化。因此，熒光法是研究鐵死亡過程中鐵離子變化的主流方法，其中最常使用的染料是 FeRhoNox-1（Fe2+ indicator，AbMole，M21552），其在結(jié)合鐵離子后會發(fā)出橙色熒光（EX/EM = 540/575 nm）。此外，還可以對細(xì)胞內(nèi)的鐵蛋白等鐵死亡重要靶點進(jìn)行WB實驗以分析其變化。
3. 脂質(zhì)過氧化檢測
脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的關(guān)鍵特征，檢測脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物是判斷鐵死亡發(fā)生的重要依據(jù)?？捎脽晒馓结槞z測出脂質(zhì)過氧化的水平，如 ABDP 581/591 C11（AbMoel，M29325），該探針在正常脂質(zhì)環(huán)境下呈紅色熒光，當(dāng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化時，其熒光顏色會轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，通過熒光顏色和強度的變化可以直觀地檢測脂質(zhì)過氧化的發(fā)生和程度。
4-Hydroxynonenal（4-HNE，4-羥基壬烯醛，M14296）也是PUFA過氧化的重要產(chǎn)物之一，4-HNE能夠與DNA和蛋白質(zhì)中的多種親核位點發(fā)生反應(yīng)，形成各種加合物。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）可以定量分析鐵死亡過程中產(chǎn)生的4-HNE-蛋白質(zhì)加合物。此外，蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）和免疫熒光利用4-HNE特異性的抗體，也可以實現(xiàn)對4-HNE蛋白質(zhì)加合物的量化或定性分析。
范例詳解：
中科院電工研究所的科研人員使用了AbMole的 ABDP 581/591 C11（AbMoel，M29325）處理TIF（TRPV1-鐵蛋白）過表達(dá)的HEK293T細(xì)胞，以檢測磁熱造成的細(xì)胞氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化。
圖 8. 在 TIF 過表達(dá)的 HEK293T 細(xì)胞中，AMF 處理期間發(fā)生脂質(zhì)過氧化[10]。
4. ROS檢測
如前所述ROS是鐵死亡的主要驅(qū)動力，因此其水平的變化可間接反映鐵死亡的發(fā)生。目前ROS的檢測方法主要是采用熒光探針法， H2DCFDA（AbMole，M9096）是一種常用的細(xì)胞滲透性熒光探針。它本身無熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解生成DCFH，DCFH不能通過細(xì)胞膜，會積聚在細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的ROS能夠氧化DCFH生成有熒光的DCF（可用FITC通道直接觀察），其熒光強度與ROS水平成正比。DHE（Dihydroethidium， 二氫乙錠，AbMole，M9696）則是另一種ROS探針，側(cè)重于檢測超氧陰離子。
范例詳解：
Sci Adv. 2024 Aug 16;10(33):eado7249.
蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的實驗人員在上述文章設(shè)計了一種磁性水凝膠（FDA-TA），它能通過調(diào)節(jié)鐵代謝來修復(fù)組織，特別是在椎間盤退行性變（IVDD）中抑制鐵死亡。來自AbMole的 H2DCFDA（AbMole，M9096）和 JC-1試劑盒（AbMole，M10454），分別被用于檢測大鼠椎間盤的髓核細(xì)胞（nucleus pulposus cells, NPCs）中ROS和線粒體膜電位的變化。
圖 9. JC-1染色后的熒光顯微圖像和H2DCFDA的流式量化分析[11]
5. GSH檢測
GSH是鐵死亡過程中的抗氧化劑，GSH在清除ROS以及參與GPX4對脂質(zhì)過氧化物的還原后會被轉(zhuǎn)化為GSSG，因此GSH是衡量鐵死亡的另一個重要標(biāo)準(zhǔn)。 Monochlorobimane（AbMole，M55675）是一種熒光染料，可用于測定細(xì)胞中GSH（EX/Em = 380/470 nm）。此外， DTNB（AbMole，M11509）可通過 DTNB 與 GSH 反應(yīng)生成黃色復(fù)合物，在412nm處測吸光度可計算 GSH 含量。
6. 形態(tài)學(xué)觀測
生物電鏡技術(shù)可直接對細(xì)胞和線粒體的形態(tài)進(jìn)行觀測。線粒體是鐵死亡過程中最顯著的超微結(jié)構(gòu)變化部位。細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時，線粒體會出現(xiàn)收縮變小、膜密度增高，嵴減少甚至消失。此外，細(xì)胞膜的完整性可能也會受到破壞，出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象。
AbMole是ChemBridge中國區(qū)官方指定合作伙伴。
| 名稱 | 目錄號 |
| Deferiprone | M2617 |
| Deferoxamine | M5558 |
| Erastin | M2679 |
| Ferric ammonium citrate (FAC) | M13544 |
| Ferrostatin-1 | M2698 |
| Imidazole ketone erastin (IKE) | M10244 |
| Liproxstatin-1 | M8531 |
| RSL3 | M9060 |
| Sorafenib | M3026 |
| Sulfasalazine | M2197 |
| FIN56 | M6731 |
| FINO2 | M11328 |
| iFSP1 | M11314 |
| L-Buthionine-Sulfoximine (BSO) | M3865 |
| ML162 | M10587 |
| ML210 | M8380 |
| Piperazine Erastin | M45069 |
| Seratrodast | M5955 |
| Trolox | M7434 |
| Zileuton | M2332 |
| Calcein-AM/PI活死細(xì)胞雙染試劑盒 | M55257 |
| H2DCFDA | M9096 |
| DTNB | M11509 |
| Dihydroethidium | M9696 |
| CCK-8試劑盒 | M4839 |
| ABDP 581/591 C11 | M29325 |
| MTT | M7007 |
| 增強型ATP細(xì)胞活力檢測試劑盒 | M55403 |
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