缺血性中風是全球致殘和致死的主要病因之一，即便大血管成功再通，仍有部分患者因“無復流”現象（大血管再通但組織未恢復灌注）預后不佳。“無復流”的核心機制——微血管阻塞，長期以來因缺乏能同時觀察大腦皮層和皮層下區域的三維成像技術而難以破解。

華中科技大學朱丹團隊在《Theranostics》（2023年第13卷第1期）發表研究，開發了一種基于雙熒光標記和組織透明化的三維微血管成像技術。通過在小鼠缺血再灌注模型中注射兩種不同顏色的番茄凝集素（分別標記所有血管和功能性血管），結合iDISCO+組織透明化技術和光學成像，首次實現了缺血后微血管阻塞的三維可視化。研究發現，微血管阻塞隨時間逐漸加重，同時涉及小動脈和毛細血管，其中毛細血管阻塞與管腔狹窄及中性粒細胞滯留密切相關，且中性粒細胞主要通過加劇管腔狹窄而非直接栓塞導致阻塞。

重要發現
01雙熒光標記策略：精準定位阻塞血管
傳統方法難以區分“存在但不流通”的血管與“正常流通”的血管。朱丹團隊設計了一種“時間差”標記法：

紅色凝集素：在缺血前注射，標記所有存活的血管（無論后續是否通暢）；

綠色凝集素：在再灌注后注射，僅標記仍有血流通過的功能性血管。

原理：若某段血管僅顯紅色，說明其在缺血后阻塞，無法讓綠色凝集素流過——這便是“微血管阻塞”的直接證據。通過這種方法，研究團隊在小鼠大腦中清晰識別出僅含紅色信號的阻塞血管，主要分布在紋狀體（比皮層更嚴重），證實了缺血核心區的微血管損傷差異。

02 iDISCO+組織透明化：從“混沌腦塊”到“透明標本”
大腦組織本身不透明，傳統切片成像僅能獲取二維信息，且易遺漏深層結構。研究團隊對比了多種透明化技術（如CUBIC、PACT、uDISCO等），最終選擇iDISCO+，因其能最大程度保留熒光信號、維持組織形態，且透明速度快。

流程：固定后的腦組織經甲醇脫水、過氧化氫漂白、二氯甲烷脫脂，最終浸泡在二芐醚（是一種用于組織光學透明化處理的溶劑）中，變得近乎透明。

效果：結合共聚焦顯微鏡或光片顯微鏡，可對1毫米厚的腦塊或全腦進行三維成像，清晰呈現皮層和紋狀體的血管網絡，甚至能分辨直徑僅數微米的毛細血管。

03 三維成像揭示阻塞動態：從“局部卡頓”到“全局癱瘓”
通過對不同再灌注時間（0.5小時、2小時、6小時）的小鼠大腦成像，發現：
阻塞范圍隨時間擴大 ：從下游毛細血管逐漸向上游小動脈蔓延，6小時時阻塞血管體積較0.5小時增加近3倍；

阻塞位置多樣化：不僅發生在有平滑肌細胞標記（αSMA抗體）的小動脈，也出現在無平滑肌的毛細血管，且毛細血管阻塞處的管腔直徑顯著縮小。

04 中性粒細胞的“幫兇”角色：擠窄血管而非堵死通道
以往研究認為中性粒細胞像“塞子”一樣直接栓塞毛細血管，但朱丹團隊的三維成像發現：

多數阻塞點無中性粒細胞：在78個阻塞點中，56個未見中性粒細胞，說明栓塞并非主要機制；

中性粒細胞加劇管腔狹窄：在有中性粒細胞的阻塞點，細胞被壓縮成“爪狀”，緊貼狹窄的血管壁，且周圍血管壁細胞（如周細胞）的細胞核呈現收縮形態。進一步實驗顯示，用抗體清除中性粒細胞后，毛細血管直徑恢復正常，阻塞程度顯著減輕。

用抗Ly6G抗體治療后I/R后缺血核心和腦微循環中中性粒細胞的微血管阻塞減少

 血管直徑的量化

創新與亮點

01 從“平面”到“立體”：破解腦深部成像難題
傳統光學顯微鏡只能觀察皮層表面血管，而臨床中風患者的深部核團（如紋狀體）常受累更重。本研究通過iDISCO+透明化和全腦三維成像，首次實現了對大腦深層微血管的系統性分析，發現紋狀體阻塞程度是皮層的2倍以上，為解釋臨床“大血管通而深部組織仍梗死”提供了直接證據。
02 從“靜態”到“動態關聯”：細胞-血管互作一目了然
結合免疫標記（如αSMA區分動脈/毛細血管、Ly6G標記中性粒細胞）和三維重建，研究團隊能精準定位阻塞點與細胞的關系。例如，通過疊加血管（紅/綠）、中性粒細胞（紫）和細胞核（藍）的信號，清晰看到中性粒細胞如何卡在狹窄的毛細血管中，以及周細胞收縮如何“掐窄”血管——這種“空間關聯分析”是傳統二維切片無法實現的。
03 從“現象描述”到“機制突破”：重新定義中性粒細胞作用
該研究推翻了“中性粒細胞主要通過栓塞導致無復流”的傳統觀點，證實其核心危害是通過釋放活性氧等物質，加劇周細胞收縮和血管狹窄。這為靶向治療提供了新方向：相比“清除中性粒細胞”，“抑制周細胞收縮”或“改善血管彈性”可能更有效。

總結與展望
朱丹團隊的這項研究，通過“雙標記+透明化+三維成像”的組合拳，為缺血性中風的微血管研究打開了新視野。其核心價值不僅在于揭示了“血管狹窄+中性粒細胞協同致病”的機制，更在于提供了一套可重復、可量化的技術平臺——未來可用于：

藥物研發：快速評估抗狹窄或抗中性粒細胞藥物對微血管的改善效果；

基礎研究：解析其他神經疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ。┲械奈⒀墚惓＃?/span>

臨床轉化：結合熒光分子成像技術，探索活體三維微血管成像的可能性。

當然，目前該技術仍需優化（如縮短透明化時間、提升單細胞分辨率），且小鼠模型與人類中風的差異需進一步驗證。但毫無疑問，這種“眼見為實”的三維成像策略，正在改寫我們對大腦微觀世界的認知。隨著技術迭代，或許有一天，醫生能通過無創三維成像實時監測患者的微血管狀態，讓“無復流”不再成為中風治療的“盲區”。

論文信息
聲明：本文僅用作學術目的。
Li Y, Xu J, Yu T, Zhu J, Xuan A, Liu X, Wang P, Li D, Zhu D. A labeling strategy for the three-dimensional recognition and analysis of microvascular obstruction in ischemic stroke. Theranostics. 2023 Jan 1;13(1):403-416. 

DOI:10.7150/thno.76879.