目前，關于大氣壓力升高對細胞培養動態影響的研究較為有限。部分研究表明，在環境壓力增至2.3 PSI時，牛內皮細胞數量及CHO細胞的蛋白產量有所提升，但這些效應存在細胞類型依賴性，可能促進或抑制細胞增殖。 本研究創新性地采用AVATAR Foundry和AVATAR Odyssey培養系統（可精確調控氧氣、二氧化碳及高壓水平），系統探究了5 PSI高壓與低氧條件聯合對人原代T細胞培養的影響。
實驗結果表明，在該培養條件下，T細胞在多種培養容器中的增殖效率顯著提升，同時細胞表型始終保持穩定。尤為值得注意的是，在CD19 CAR-T與NALM6細胞共培養的殺傷實驗中，特定低氧培養條件下的CD19 CAR-T細胞展現出持續的腫瘤殺傷能力，且在反復攻擊腫瘤細胞時未出現耗竭現象。此外，低氧條件下培養的CAR-T細胞的GLUT1表達量顯著上升，這一分子已被證實與增強抗腫瘤效力、減輕細胞耗竭以及延長存活期密切相關。
這一發現為細胞治療產品的規模化生產提供了創新解決方案，不僅能夠同時提升細胞產量和功能活性，還能確保細胞特性的穩定性，直接響應了細胞基因治療領域對高效能、規模化生產的迫切需求。本研究不僅證實了低氧高壓培養的協同增效作用，也為優化細胞治療生產工藝提供了重要的理論與實踐依據。
 
材料與方法
本研究采用健康供體來源的凍存原始CD3+ T細胞進行實驗。復蘇后的細胞使用含10%熱滅活胎牛血清（HI-FBS）的RPMI培養基，并添加人源T細胞激活劑CD3/28 Dynabeads及重組人IL-2（rhIL-2）進行培養。培養條件設置為三種：常規CO ₂培養箱（NI）、AVATAR培養系統（AVT）15% O ₂+5 PSI和AVATAR培養系統（AVT）10% O ₂+5 PSI。
次日，使用第三代CD19-CAR慢病毒或STEAP1-CAR慢病毒對細胞進行轉導，并將細胞返回各自的培養環境中繼續擴增，最后進行凍存。每2-3天使用細胞計數儀進行細胞擴增與活力檢測，同時利用流式細胞術分析CAR表達及細胞表型。采用兩種針對NALM6-mCHERRY-Luc-Puro靶細胞的殺傷實驗進行功能活性評估：
? 持續殺傷實驗：將CAR陽性效應細胞與靶細胞按不同比例長期共培養。使用流式細胞術或Axion OMNI活細胞成像系統測定CAR特異性殺傷活性，參照組為未轉導（UTD）對照組、單純的NALM6靶細胞組及熒光計數微球。此實驗在常規培養箱中進行。
? 反復殺傷實驗：按上述方法建立共培養體系，每48-72小時取樣進行流式檢測并補充新鮮的NALM6靶細胞。每次補充靶細胞視為新一輪“激發”，該過程持續進行，直至效應細胞功能衰竭。數據通過NALM6細胞在時間推移中的動態變化進行呈現。
 
AVATAR 培養系統
臨床前及 GMP 級細胞治療生產平臺
AVATAR Odyssey系統通過精確調控氧氣水平和壓力，能夠篩選理想的環境條件，從而增強細胞治療的效力和產量。此外，該系統還可以模擬腫瘤微環境（TME）等生理條件，為研究提供高度仿真的測試環境。在確認了理想的環境條件后，將這些條件應用于全封閉的AVATAR Foundry系統，該系統符合GMP標準，專用于細胞治療產品的生產。這一無縫銜接確保了從研究到生產的有效性和可靠性，推動了細胞治療領域的進步。

實驗結果 
1. 高壓條件下擴增的CD19 CAR-T細胞顯著提高細胞產量
本研究對比了健康供體T細胞在常規培養箱（NI）和AVATAR Odyssey（AVT）系統中的生長情況：
A. 健康供體T細胞分別在常規培養箱（NI）和不同高壓條件下的AVATAR Odyssey系統中進行擴增（12名健康供體的平均值±標準誤差）。B. T細胞在不同培養容器中分別于常規培養箱或5 PSI高壓條件下培養7天。
結果表明，AVT條件下的T細胞產量顯著高于常規培養箱。這一發現為提高CAR-T細胞的生產效率提供了新的思路，有望在臨床應用中提升治療效果。

2. 低氧和高壓條件下培養的T細胞轉導效率較常規培養箱增強或相當
健康供體T細胞的CD19 CAR轉導效率分析：細胞在激活后第1天使用MOI為3的CD19-CAR慢病毒進行轉導，轉導后細胞分別在常規培養箱(NI)或AVATAR Odyssey(AVT)系統的透氣袋中培養8天，通過流式細胞術檢測CAR表達水平。A.供體1數據，B.供體2數據。
數據顯示，在AVT培養條件下，T細胞的平均轉導效率與常規培養條件相比相當或有所提高。這一發現提示低氧和高壓環境在T細胞轉導中的潛在優勢，為今后T細胞治療的研究提供了新的思路。

3. 低氧高壓環境下培養的T細胞GLUT1表達增加而表型保持穩定
隨著壓力的增加，細胞表型變化不顯著，而降低氧濃度則會顯著影響GLUT1的表達。
A. 供體樣本分析顯示，CCR7+CD45RA-中央記憶T細胞和CCR7+CD45RA+初始/干細胞樣記憶T細胞的比例較高，但在不同培養條件下未觀察到顯著差異。
B. 經STEAP1 CAR慢病毒轉導的T細胞在不同低氧條件下培養8天后，可觀察到隨著氧濃度降低，GLUT1高表達細胞亞群的出現。
C. 另一供體樣本（STEAP1 CAR-T細胞，培養袋擴增8天）結果顯示，隨著氧濃度的降低，高表達GLUT1細胞亞群的比例顯著增加（高表達GLUT1細胞被標記為"glut1++"）。圖中展示了不同GLUT1表達水平細胞的代表性點陣圖。
數據顯示，低氧條件顯著增強T細胞的GLUT1表達，而表型亞群的穩定性在不同壓力條件下保持相對不變，這為研究T細胞在微環境中的適應性提供了重要依據。

4. 低氧高壓環境擴增的CD19 CAR-T細胞在持續殺傷實驗中展現出更優效力
與常規培養箱中培養的細胞相比，在低氧高壓條件下培養的細胞具有更高療效：
A. 在不同條件下擴增的CD19 CAR-T細胞與表達mCHERRY熒光蛋白的NALM6腫瘤細胞置于常規培養箱的96孔板中共培養，5天后通過Axion OMNI系統成像（左圖顯示熒光圖像，右圖通過AxisVue軟件定量mCHERRY覆蓋率），CAR-T:NALM6=1:16。
B. CD19 CAR-T細胞與NALM6-mCHERRY細胞按不同效靶比共培養7天，使用流式細胞儀檢測時加入熒光計數微球，根據存活NALM6細胞群計算殺傷率。
這些研究結果表明， 在低氧高壓環境中擴增的CD19 CAR-T細胞可能在持續殺傷實驗中展現出更優效力，具有廣闊的臨床應用前景。

5. 低氧高壓環境擴增的CD19 CAR-T細胞在反復殺傷實驗中展現出持久殺傷活性
低氧高壓培養條件下獲得的CAR-T細胞在反復殺傷實驗時表現出更強的持久性。供體1和2經可溶性CD3/CD28激活劑預處理1天后，用CD19-CAR慢病毒轉導，隨后進行7天擴增并冷凍保存。將CAR-T效應細胞與NALM6-mCHERRY靶細胞按1:2比例于48孔板中置于常規培養箱共培養。48小時后取樣，在熒光計數微球存在下通過流式細胞儀檢測培養體系中存活NALM6細胞濃度。補充新鮮NALM6細胞及培養基后繼續共培養72小時再次取樣，該流程循環進行。效應細胞共經歷6輪連續攻擊。

結果顯示，與常規培養條件相比，低氧高壓擴增組在經歷多次攻擊后，仍能有效維持NALM6細胞濃度的顯著降低。每個數據點代表一次獨立攻擊實驗，結果為雙重復實驗的平均值±標準差，C1-C6分別代表第1至第6次攻擊。
 
未來計劃 
本研究的下一步計劃包括體內與實體瘤建模、優化培養條件、細胞因子分析及RNA測序等多個環節。
研究表明，使用AVATAR Odyssey和AVATAR Foundry系統能夠有效促進T細胞在模擬實體瘤內部環境條件下的適應性培養。這種方法通過在更接近生理環境的條件下培養腫瘤細胞，并對T細胞產品進行功能分析，預示著在動物模型及臨床應用中有可能獲得更具預測性的結果。這些經過適應性培養的T細胞能經歷代謝轉變，從而增強它們在低氧環境（氧氣濃度較低）中的生存能力。

在本實驗中，T細胞通過轉導靶向卵巢癌標志物（ROR1）的嵌合抗原受體（CAR）進行改造，并在3% O ₂和4 PSI壓力條件下擴增。與此同時，前列腺癌細胞系則在1% O ₂和2 PSI壓力的腫瘤微環境中進行適應性培養。細胞毒性試驗中，CAR-T細胞需在模擬腫瘤微環境下對抗腫瘤細胞，并每48-72小時接受新一輪的腫瘤細胞攻擊。實驗結果顯示，在低氧環境中培養的T細胞在隨后的攻擊中展現出更強的腫瘤生長抑制能力。這一發現表明，低氧暴露或許能使T細胞更好地適應實體瘤的惡劣微環境，從而提升其治療效果。
 
總結與討論 
本研究通過對AVATAR系統中低氧與高壓條件下T細胞的培養，得出以下重要結論：
1. 在低氧與高壓環境下，T細胞的增殖能力得到了適度提升，且隨著壓力的增加，細胞擴增的促進作用更為顯著。這表明，培養環境的調整能夠有效影響T細胞的增殖特性。
2. 受低氧高壓培養條件的影響，T細胞轉導效率表現出個體差異性。部分供體細胞的轉導效率得到了提升，而另一些則未見顯著變化，提示需進一步探討供體細胞特性的影響因素。
3. 常見的T細胞亞群表面標志物，這說明低氧高壓條件對細胞的基本表型并無明顯干擾。
4. 在低氧條件下培養的CAR-T細胞中，觀察到GLUT1高表達的細胞亞群，其表達水平顯著高于常規活化擴增的典型值。根據文獻（Shi 2024）的報道，GLUT1的過表達與增強的抗腫瘤效能及代謝適應性相關，提示該現象可能與細胞改善的功能狀態密切關聯。
5. 在生理相關條件下培養的CAR-T細胞，在延長觀察周期及持續攻擊實驗中，展現出了更強的殺傷效力及持續的細胞毒性。這為CAR-T細胞治療的臨床應用提供了有利依據，強調培養條件優化的重要性。
綜上所述，通過對培養條件的調整，T細胞的增殖能力與功能特性均得到了顯著改善，提供了進一步優化細胞治療策略的潛力。