自閉癥譜系障礙（ASD）是神經(jīng)發(fā)育障礙，表現(xiàn)為兒童早期出現(xiàn)社交、溝通和行為障礙。流行病學(xué)研究表明，妊娠期和嬰兒期維生素D缺乏（稱為發(fā)育期維生素D缺乏）與后代患自閉癥的風(fēng)險(xiǎn)之間存在關(guān)聯(lián)。發(fā)育期維生素D（DVD）缺乏癥是自閉癥的一個(gè)流行病學(xué)上已確立的風(fēng)險(xiǎn)因素。另外，新興研究也發(fā)現(xiàn)了腸道微生物群在自閉癥中的作用。因此，本研究旨在探討DVD缺乏癥對(duì)廣泛的自閉癥相關(guān)行為表型和腸道健康的影響。

方法
對(duì)維生素D缺乏組和對(duì)照組的小鼠進(jìn)行母性行為觀察、超聲波發(fā)聲（USV）測(cè)試、幼鼠尋回測(cè)試、社交玩耍行為測(cè)試、重復(fù)性自我梳理行為測(cè)試以及腸道生理評(píng)估、腸道微生物測(cè)量等。母性行為主要記錄10次觀察期間母體行為數(shù)量，例如舔舐/梳理和弓背哺乳。在超聲波發(fā)聲測(cè)試中，將幼鼠與母鼠分離，放置在隔音箱中，通過(guò)放置在幼鼠頭部上方約10厘米的麥克風(fēng)進(jìn)行收集，使用諾達(dá)思的聲音行為分析系統(tǒng)(UltraVox XT)進(jìn)行持續(xù)三分鐘的記錄并分析。幼鼠尋回測(cè)試主要測(cè)量尋回母鼠幼崽第一只到第五只幼崽的潛伏期。社交玩耍行為測(cè)試中，使用諾達(dá)思的行為觀察記錄分析系統(tǒng)(The Observer XT)記錄10分鐘動(dòng)物自由互動(dòng)過(guò)程并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，記錄社交玩耍行為的參數(shù)包括互動(dòng)潛伏期、猛撲頻率、壓制和總玩耍持續(xù)時(shí)間等。重復(fù)性自我梳理行為測(cè)試是使用諾達(dá)思的行為觀察記錄分析系統(tǒng)對(duì)動(dòng)物梳理自身任何部位的自我梳理行為的次數(shù)和持續(xù)時(shí)間進(jìn)行評(píng)分。幼崽出生的當(dāng)天被指定為出生后第0天(P0)。
 

  結(jié)果
DVD缺乏癥改變了與自閉癥相關(guān)的母性和后代行為
在本研究中，觀察到DVD缺陷型母鼠舔舐/梳理行為的增加（圖1），這反映了母鼠和幼鼠的焦慮或應(yīng)激狀態(tài)增強(qiáng)，因?yàn)樵趪X動(dòng)物中，母鼠應(yīng)激與此類梳理行為的頻率相關(guān)。嚙齒類動(dòng)物母鼠照料行為的變化已被證明會(huì)影響介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，進(jìn)而影響母性行為。
  圖1   圖2

為了探究幼鼠如何與母鼠互動(dòng)和溝通，研究者進(jìn)一步測(cè)量了幼鼠的超聲波發(fā)聲（USV）。幼鼠早期最基本的溝通方式是與母鼠分離時(shí)發(fā)出的USV。DVD缺乏會(huì)影響P9時(shí)的USV，DVD缺乏的幼鼠在P9時(shí)發(fā)出更多的數(shù)量和更長(zhǎng)時(shí)間的叫聲。就記錄USV時(shí)的母體行為而言，DVD缺乏會(huì)增加幼崽在P9時(shí)的USV數(shù)量和叫聲持續(xù)時(shí)間（圖2），這與母鼠更快地尋回幼崽速度相對(duì)應(yīng)。幼崽的USV是母鼠尋回幼崽的重要觸發(fā)因素。增加的USV可能代表DVD缺乏幼崽的高度焦慮或壓力狀態(tài)。在這個(gè)年齡段，幼崽的USV可能驅(qū)動(dòng)母體行為。

與對(duì)照組大鼠相比，缺乏DVD的青少年大鼠的猛撲行為顯著減少（圖3），總玩耍時(shí)長(zhǎng)或互動(dòng)潛伏期未發(fā)現(xiàn)差異。與對(duì)照組相比，DVD缺乏組大鼠的自我梳理次數(shù)增加（圖4）。
 

圖3
  圖4

本文研究中P35 DVD缺陷動(dòng)物在與同類動(dòng)物相處時(shí)表現(xiàn)出更高的自我梳理頻率，這與它們減少的社交互動(dòng)相一致。

DVD缺乏癥改變了與自閉癥相關(guān)的腸道健康相關(guān)結(jié)果
研究結(jié)果表明，雖然DVD缺乏癥并未改變母體腸道微生物組的組成，但DVD缺乏癥后代和對(duì)照組后代的腸道微生物組之間存在差異。研究發(fā)現(xiàn)了四種細(xì)菌（Akkermansia、Fusicatenibacter、Allobaculum和Turicibacter），其在后代中的相對(duì)豐度因 DVD 缺乏而發(fā)生顯著改變。

在行為方面，發(fā)現(xiàn)Phascolarctobacterium菌屬和Paracteroides菌屬與DVD缺乏組中猛撲行為的頻率呈負(fù)相關(guān)，但在對(duì)照組中則不然。Parasutterella屬也與對(duì)照組中猛撲行為的頻率呈負(fù)相關(guān)，但在DVD缺乏組中則不然。

另外，與對(duì)照組動(dòng)物相比，DVD缺陷型動(dòng)物的腸道絨毛長(zhǎng)度有所降低。并且，與對(duì)照組相比，DVD缺陷動(dòng)物回腸中的ProPIonate（圖5A）水平升高，然而，acetate（圖5B）和butyrate（圖5C）水平?jīng)]有差異。
 

圖5   總結(jié)
本研究的主要目標(biāo)是DVD缺乏癥對(duì)廣泛的自閉癥相關(guān)行為表型和腸道健康的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，維生素D缺乏的大鼠母親表現(xiàn)出改變的母性行為，DVD缺乏的幼鼠表現(xiàn)出增加的超聲波發(fā)聲，并且作為青少年，表現(xiàn)出社交行為障礙和增加的重復(fù)性自我梳理行為。DVD缺乏癥對(duì)腸道健康有顯著影響，表現(xiàn)為微生物群的改變、絨毛長(zhǎng)度的減少和回腸Propionate水平的升高。本研究的自閉癥流行病學(xué)驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)暴露的動(dòng)物模型顯示了更廣泛的自閉癥相關(guān)行為表型，以及現(xiàn)在與社交行為缺陷相關(guān)的腸道微生物群的改變，從而提出了DVD缺乏癥誘導(dǎo)的ASD樣行為可能是由于腸道健康的改變。
參考文獻(xiàn)
Tamang M K, Ali A, Pertile R N, et al. Developmental vitamin D-deficiency produces autism-relevant behaviours and gut-health associated alterations in a rat model[J]. Translational Psychiatry, 2023, 13(1): 204.

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