對抗耐藥菌新利器：毛細管波微生物反應(yīng)器革新噬菌體篩選技術(shù)

——PIpeJet 納升級微量分液模塊助力噬菌體療法研究
在抗生素過度使用的當下，多重耐藥病原菌數(shù)量不斷攀升，嚴重威脅人類健康。噬菌體療法憑借高度特異性，成為極具潛力的治療選擇。然而，傳統(tǒng)的噬菌體篩選方法，如在雙層瓊脂平板上進行細菌培養(yǎng)和噬菌體添加以引發(fā)細菌裂解，不僅操作繁瑣、工作量大，而且難以實現(xiàn)并行化和自動化，嚴重限制了篩選效率。在此背景下，開發(fā)一種高效、快速且能實現(xiàn)高通量篩選的方法至關(guān)重要，不僅能加速噬菌體療法的臨床應(yīng)用，還可能為耐藥菌感染帶來新的突破。

本次介紹的文章是《PhagoScreener: A novel phagogram platform based on a capillary-wave microbioreactor》，來自德國布倫瑞克工業(yè)大學生物化學工程研究所的研究團隊，于2024年發(fā)表在《New BIOTECHNOLOGY》雜志。該團隊建立了一套新的基于毛細管波微生物反應(yīng)器（capillary-wave microbioreactor ，cwMBR）的噬菌體篩選技術(shù)，有望加速噬菌體研究的臨床應(yīng)用。

實驗步驟

• 1.菌株與噬菌體準備：大腸桿菌K12 MG1655在復合培養(yǎng)基中搖瓶過夜培養(yǎng)作為預(yù)培養(yǎng)物。噬菌體 MM02和EASG3分別用噬菌體緩沖液復蘇后進行直接的噬斑測定，以確定噬菌體滴度，并制備初級、次級裂解液備用。
• 2.cwMBR 平臺搭建：cwMBR 芯片由飛秒激光直寫結(jié)合選擇性濕法蝕刻光敏玻璃制成，繼而置于 3D 打印的平臺支架中。支架由方形聚氯乙烯板和電子激勵器組成。將整體平臺放入連接恒溫器和超聲波加濕器的培養(yǎng)箱內(nèi)，通過垂直振蕩技術(shù)混合液滴產(chǎn)生特定波型的毛細管波，以微渦流的形式引起對流，通過相關(guān)軟件、聲卡和放大器驅(qū)動，藍色 LED 用作吸光度測量的光源。

圖 1. cwMBR 平臺：3D 打印的cwMBR支架、cwMBR芯片及其他組件
支架底座最多可包含 9 個入口，每個入口容納 1 個 cwMBR 芯片。入口將 cwMBR 和光纖固定在適當?shù)奈恢茫员銈鞲衅髯x出；蓋子和濕潤的海綿可最大限度地減少 cwMBR 芯片的蒸發(fā)；藍色 LED 用作吸光度測量的光源。

• 3.Biofluidix 相關(guān)操作：使用德國 BioFluidix公司開發(fā)的 PipeJet Nanodispenser 納升級微量分液模塊評估吸光度傳感器系統(tǒng)對微生物培養(yǎng)液濃度測量的適用性。先向 cwMBR 芯片半填充 3.5 μL 氯化鈉溶液，再用PipeJet納升級微量分液模塊以 0.5 μL 的增量添加濃縮大腸桿菌培養(yǎng)物（OD≈16）直至體積達 7 μL，測定每步添加后的電路電壓，建立電壓與細胞濃度關(guān)系。
• 4.培養(yǎng)實驗與噬菌體篩選：分別在 cwMBR 和 96 孔板中培養(yǎng)大腸桿菌并對比，同時進行噬菌體篩選實驗。將預(yù)培養(yǎng)的大腸桿菌稀釋后，7 μL 用PipeJet納升級微量分液模塊加入 cwMBR，100 μL 加入 96 孔板。cwMBR 培養(yǎng)時控制溫度、濕度和振蕩條件，96 孔板在酶標儀中培養(yǎng)，設(shè)置振蕩和不振蕩組，定期測量吸光度和細胞計數(shù)。噬菌體篩選實驗中，大腸桿菌培養(yǎng)至特定光密度后添加不同濃度的噬菌體，設(shè)置生長對照，同步培養(yǎng)并測量。
• 5.統(tǒng)計分析：所有實驗設(shè)置三個重復，采用單因素方差分析判斷不同噬菌體、噬菌體感染復數(shù)（MOI）或培養(yǎng)系統(tǒng)對最終細胞數(shù)量的影響。

實驗結(jié)論

• 1.傳感器系統(tǒng)性能良好：開發(fā)的基于光電阻的吸光度傳感器系統(tǒng)成本效益高、可高度并行化，測量結(jié)果與細胞濃度在一定范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（R² = 95.0%），適用于噬菌體篩選及其他細胞相關(guān)應(yīng)用（圖2）。

圖 2 . 基于 Arduino 的吸光度傳感器系統(tǒng)在不同光密度（λ=600nm，范圍為 0 至 8.32）和細胞數(shù)量（范圍為 0 至 4.23×10 ⁹ mL ^-1 ）下相對于 OD=0 的電壓變化此圖展示了毛細管波微生物反應(yīng)器（cwMBR）芯片中的數(shù)據(jù)情況。

• 2.cwMBR 培養(yǎng)優(yōu)勢顯著：cwMBR 與振蕩的 96 孔板培養(yǎng)效果相似且優(yōu)于非振蕩的 96 孔板。cwMBR 中大腸桿菌生長良好，細胞密度和生長速率較高。其親水性玻璃表面減少噬菌體吸附，芯片可重復使用，且未來可高度并行化和自動化。
• 3.適用于不同噬菌體篩選：cwMBR 適用于不同噬菌體如MM02 和 EASG3的篩選，可區(qū)分其裂解動力學差異，同時在線裂解測量可加速噬菌體篩選過程，未來有望用于高通量篩選和個性化醫(yī)療。

綜上所述，cwMBR 為噬菌體篩選提供了一種經(jīng)濟、高效的替代方案，快速生成噬菌體篩選結(jié)果。結(jié)合液體處理系統(tǒng)德國BioFluidix公司的PipeJet Nanodispenser 納升級微量分液模塊，cwMBR 的并行化能力有效提升，可快速篩選大量噬菌體庫以及噬菌體 - 噬菌體、噬菌體 - 抗生素組合，為個性化醫(yī)療中的噬菌體療法乃至其他應(yīng)用（如抗生素敏感性測試）提供有力支持。后續(xù)研究將針對臨床更相關(guān)的微生物開展噬菌體篩選實驗，并探索其最佳初始細胞濃度，進一步拓展 cwMBR 的應(yīng)用潛力。

更多信息請參考原文：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678424005363

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