FluorCam多光譜熒光成像 應用于 分子生物學研究——
擬南芥基因敲除：對一種病毒產生抗性，卻引發另一種病毒易感？
      馬鈴薯 Y 病毒屬（Potyvirus），是一類嚴重影響植物生長生產的植物病毒屬，有數百個種，包括大豆花葉病毒（SMV）、三葉草黃脈病毒（CIYVV）、蕪菁花葉病毒（TuMV）deng 等。植物中的翻譯起始因子4E是對馬鈴薯Y病毒屬敏感的一個小家族。當作物中編碼 eIF4E蛋白的天然抗性等位基因缺失時，敲除這些4E家族基因，可以賦予作物遺傳抗性。 eIF4E1是4E家族中一個對CIYVV敏感的翻譯起始因子，本研究探討了利用敲除 eIF4E1對擬南芥的病毒抗性的雙重影響.
      研究結果表明，敲除eIF4E1后，對CIYVV敏感的植株對三葉草黃脈病毒（ClYVV）表現出抗性，但對蕪菁花葉病毒（TuMV）的敏感性顯著增強。而通過CRISPR/Cas9基因編輯技術構建功能抗性等位基因eIF4E1可避免對TuMV的超敏反應，同時保留對ClYVV的抗性。研究提示，基因敲除策略可能因病毒利用其他同源因子而存在風險，而模擬天然抗性等位基因是更安全有效的策略。             
      FluorCam多光譜熒光成像系統，除了具備葉綠素熒光成像，可以檢測植物光合活性以外，還具備多光譜熒光成像功能，比如FPs熒光蛋白成像、UV-MCF紫外激發多光譜熒光成像等。在這項研究中，FluorCam便承擔了檢測在病毒侵染下不同基因型擬南芥的衰老、追蹤GFP標記病毒分布及量化的雙重角色。  

• eIF4E1功能喪失與TuMV感染癥狀加重有關

使用帶GFP標記的TuMV（TuMV-GFP UK1）感染三個基因型的擬南芥，分別為野生型WT；敲除 eIF4E1對CIYVV具抗性的基因型（ eif4e1 ^KO）；敲除 eIF iso4E對TuMV具抗性的基因型（ eifiso4e ^KO）。使用FluorCam檢測感染14天、21天之后擬南芥葉綠素熒光變化（表征葉片衰老情況）及GFP表達情況（即TuMV病毒積累程度）。從結果可知， eifiso4e ^KO因其具備的病毒抗性，而無明顯的病毒侵染，性狀和葉綠素熒光水平無明顯變化，而eif4e1 ^KO的GFP信號更強，說明其病毒積累更多，葉綠素熒光成像結果也顯示，其感染癥狀比野生型更為明顯，表現為更嚴重早衰（葉綠素熒光下降）、新葉發育停滯。  

• 基因功能驗證：

• 恢復eIF4E1表達后，植株對TuMV的敏感性和病毒積累量恢復至野生型水平

為了確認 eif4e1 ^KO對TuMV易感是否由 eIF4E1缺失有關，通過構建了兩個互補系 eif4e1KO ; eIF4E1-1和 eif4e1KO ; eIF4E1-2，在感染TuMV-GFP UK1后，于17天后，分析了它們的表型。FluorCam成像結果表明， eif4e1KO ; eIF4E1-1和 eif4e1KO ; eIF4E1-2的病毒易感性表現恢復到了與野生型相似水平，比 eif4e1 ^KO具有更高的TuMV抗性，證明了 eIF4E1的敲除缺失是 eif4e1 ^KO突變體易感性和病毒積累增加的唯一原因。  

•  CRISPR/Cas9基因編輯技術將eIF4E1轉化為抗性等位基因eIF4E1^N176K  

研究中，模擬豌豆 eIF4E等位基因中與抗馬鈴薯病毒屬相關的自然突變基因，通過基因編輯的方法獲得非轉基因的 eIF4E1 ^N176K植株，侵染實驗的結果證明，該基因編輯株對TuMV無超敏反應，且保留對ClYVV的抗性。  
結合研究中的其他實驗結果，得出結論，敲除eIF4E1雖賦予植株ClYVV的抗性，但卻引發了對TuMV的過度敏感。CRISPR/Cas9基因編輯技術模擬天然抗性等位基因是更優策略，既可維持抗性，又避免對其他病毒的易感性。研究強調基因敲除抗性育種存在潛在風險，而功能性等位基因編輯更具應用前景。

• FluorCam多光譜熒光成像助力葉片衰老和病毒感染程度檢測

作為研究中的主要檢測手段，FluorCam提供了多方面的數據支撐。葉綠素熒光成像結果體現了葉綠素熒光強度變化量化葉片衰老進程，直觀反映病毒感染引發的早衰現象，從而反映葉片衰老。得力于系統非侵入性檢測的優點，可以實現實時追蹤植株生理狀態，避免傳統取樣對實驗的干擾和珍貴樣品的破壞。而系統具備的GFP熒光蛋白檢測則為可視化病毒分布、量化病毒積累提供、動態監測感染不同階段病毒與宿主互作的時序性變化提供了可靠數據。FluorCam兼具的兩項技術共同為擬南芥抗病毒分子生物學研究提供了高效、直觀的表型和分子水平分析工具。

參考文獻：
Zafirov, Delyan, et al. "When a knockout is an Achilles’ heel: Resistance to one potyvirus species triggers hypersusceptibility to another one in Arabidopsis thaliana."Molecular Plant Pathology, 22.3 (2021): 334-347.