實時熒光定量PCR反應體系中熒光信號物質使用染料法及探針法的區別_abio生物試劑品牌網
前言
實時熒光定量PCR（qPCR）是一種監控核酸擴增的技術，在PCR反應體系中加入熒光物質，利用熒光信號的變化對PCR過程進行實時監控，以此實現對初始模板的定量分析。根據所加入的熒光化學物質不同可分為：染料法和探針法。
SYBR Green染料法原理
染料法利用能與DNA雙鏈結合的染料來實現檢測，如SYBR Green I。該染料在游離狀態下幾乎不發出熒光信號，一旦與雙鏈DNA的雙螺旋小溝結合，其熒光信號增強約1000倍。PCR擴增時，每形成一條雙鏈，就有相應染料與雙鏈DNA結合，產生熒光信號，檢測到的熒光信號強度與PCR產物的數量呈正相關。SYBR Green I的最大吸收波長約在497 nm，發射波長最大約在520 nm，與FAM熒光染料的光譜性質類似，因此在qPCR設備中都是第一通道檢測，即“FAM/SYBR Green I”通道。
染料法的缺點是染料會與任何雙鏈DNA序列結合。這意味著您還可以檢測到非特異性qPCR產物（如引物二聚體）發出的熒光。為了消除這種風險，可以通過熔解曲線分析來檢查反應特異性，或使用TaqMan方法。
圖1：使用染料法和探針法原理示意圖
TaqMan探針法原理
在qPCR反應體系中，加入一對引物和一個特異性的TaqMan熒光探針，探針的5′端標記一個熒光基團，3′端標記一個淬滅基團。探針完整時，熒光基團發射的熒光信號被淬滅基團所吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴增時，引物和探針與模板特異性結合，當延伸到探針結合的位置時，Taq酶利用5'端外切酶活性將探針水解切割，熒光基團和淬滅基團分離，熒光信號開始積累。所以，每形成一條DNA雙鏈，就會水解一個探針，釋放一份熒光基團以積累熒光信號，檢測到的熒光信號強度與PCR產物的數量呈正相關。
與染料法相比，TaqMan探針的使用更昂貴，但也提供了兩個顯著的優勢：
1. TaqMan 檢測僅測量靶序列的擴增進程，因為探針具有靶標特異性。
2. 通過向預混液中添加不同的引物和具有不同熒光基團的TaqMan探針，您可以在單個反應中監測多種qPCR產物的量。這種多重方法允許您在每個熱循環結束時檢測多個熒光信號。
一般qPCR設備會配有1個或多個不同的熒光通道，根據儀器熒光通道的配置，可以通過對不同靶標基因的探針標記不同的熒光基團，以實現多重PCR的檢測。常用的熒光基團及淬滅基團如下：
圖2：常用的熒光基團及淬滅基團
QX系列實時熒光定量PCR系統
杰萊美QX系列實時熒光定量PCR系統，采用先進的雙PID算法和溫控技術，結合免維護光學系統和靈活的連接操控方式。這不僅提供了更快的升降溫速度，同時還帶來了更好的溫控精準度和均一性，以確保您實驗數據的準確性和可靠性。配合業界領先的熒光定量PCR數據處理軟件，QX系列將熒光信號處理、專業的數據計算方法、嚴謹的統計學分析功能整合為一站式解決方案，從核酸到蛋白研究，滿足探索各種科學問題的實驗需要，重新定義了科研級熒光定量PCR系統。
該系統最大可實現單管6重熒光檢測，6通道96孔檢測時間不超過5秒，實現對珍貴樣本最大限度的利用和數據挖掘。另外，可兼容各種常見的熒光基團或染料，激發/檢測波長470-725nm。白色LED提供更寬泛的激發光波長，定制濾光片組激發/檢測波長范圍可達到360-750nm，還可升級FRET通道開展蛋白質熱遷移分析或FRET探針監測。
實時熒光定量PCR（qPCR）是一種監控核酸擴增的技術，在PCR反應體系中加入熒光物質，利用熒光信號的變化對PCR過程進行實時監控，以此實現對初始模板的定量分析。根據所加入的熒光化學物質不同可分為：染料法和探針法。
SYBR Green染料法原理
染料法利用能與DNA雙鏈結合的染料來實現檢測，如SYBR Green I。該染料在游離狀態下幾乎不發出熒光信號，一旦與雙鏈DNA的雙螺旋小溝結合，其熒光信號增強約1000倍。PCR擴增時，每形成一條雙鏈，就有相應染料與雙鏈DNA結合，產生熒光信號，檢測到的熒光信號強度與PCR產物的數量呈正相關。SYBR Green I的最大吸收波長約在497 nm，發射波長最大約在520 nm，與FAM熒光染料的光譜性質類似，因此在qPCR設備中都是第一通道檢測，即“FAM/SYBR Green I”通道。
染料法的缺點是染料會與任何雙鏈DNA序列結合。這意味著您還可以檢測到非特異性qPCR產物（如引物二聚體）發出的熒光。為了消除這種風險，可以通過熔解曲線分析來檢查反應特異性，或使用TaqMan方法。
圖1：使用染料法和探針法原理示意圖
TaqMan探針法原理
在qPCR反應體系中，加入一對引物和一個特異性的TaqMan熒光探針，探針的5′端標記一個熒光基團，3′端標記一個淬滅基團。探針完整時，熒光基團發射的熒光信號被淬滅基團所吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴增時，引物和探針與模板特異性結合，當延伸到探針結合的位置時，Taq酶利用5'端外切酶活性將探針水解切割，熒光基團和淬滅基團分離，熒光信號開始積累。所以，每形成一條DNA雙鏈，就會水解一個探針，釋放一份熒光基團以積累熒光信號，檢測到的熒光信號強度與PCR產物的數量呈正相關。
與染料法相比，TaqMan探針的使用更昂貴，但也提供了兩個顯著的優勢：
1. TaqMan 檢測僅測量靶序列的擴增進程，因為探針具有靶標特異性。
2. 通過向預混液中添加不同的引物和具有不同熒光基團的TaqMan探針，您可以在單個反應中監測多種qPCR產物的量。這種多重方法允許您在每個熱循環結束時檢測多個熒光信號。
一般qPCR設備會配有1個或多個不同的熒光通道，根據儀器熒光通道的配置，可以通過對不同靶標基因的探針標記不同的熒光基團，以實現多重PCR的檢測。常用的熒光基團及淬滅基團如下：
圖2：常用的熒光基團及淬滅基團
QX系列實時熒光定量PCR系統
杰萊美QX系列實時熒光定量PCR系統，采用先進的雙PID算法和溫控技術，結合免維護光學系統和靈活的連接操控方式。這不僅提供了更快的升降溫速度，同時還帶來了更好的溫控精準度和均一性，以確保您實驗數據的準確性和可靠性。配合業界領先的熒光定量PCR數據處理軟件，QX系列將熒光信號處理、專業的數據計算方法、嚴謹的統計學分析功能整合為一站式解決方案，從核酸到蛋白研究，滿足探索各種科學問題的實驗需要，重新定義了科研級熒光定量PCR系統。
該系統最大可實現單管6重熒光檢測，6通道96孔檢測時間不超過5秒，實現對珍貴樣本最大限度的利用和數據挖掘。另外，可兼容各種常見的熒光基團或染料，激發/檢測波長470-725nm。白色LED提供更寬泛的激發光波長，定制濾光片組激發/檢測波長范圍可達到360-750nm，還可升級FRET通道開展蛋白質熱遷移分析或FRET探針監測。
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