一、引言

動物模型在精神神經(jīng)疾病研究中具有重要價值，明暗箱實驗因其操作簡便、無需外部刺激等特點，已成為評估焦慮行為的金標(biāo)準(zhǔn)。該實驗基于嚙齒類動物趨暗避光的本能行為，通過測量明暗箱穿梭次數(shù)、停留時間等參數(shù)反映焦慮水平。研究表明，抗焦慮藥物能顯著增加小鼠在明亮區(qū)域的探索行為，而抑郁模型動物則表現(xiàn)出活動量減少等特征。然而，實驗條件的微小差異可能導(dǎo)致結(jié)果偏差，因此有必要對影響實驗結(jié)果的系統(tǒng)性因素進行深入探討。

現(xiàn)有研究多聚焦單一變量影響，缺乏多因素交互作用的系統(tǒng)分析。光照作為核心環(huán)境因子，其波長、強度及空間分布均可能影響動物行為表現(xiàn)。此外，晝夜節(jié)律作為內(nèi)源性生物鐘，與光照條件共同調(diào)控生理節(jié)律，二者協(xié)同作用對情緒行為的影響尚未明確。本研究通過構(gòu)建多維度實驗體系，系統(tǒng)解析各因素對焦慮行為的影響權(quán)重，為實驗標(biāo)準(zhǔn)化提供理論依據(jù)。

 

二、材料與方法

（一）實驗裝置

實驗采用定制化明暗箱系統(tǒng)，箱體主體采用醫(yī)用級ABS材料，分為明室（30×27×27 cm3）與暗室（18×27×27 cm3），中間設(shè)置可拆卸隔板。明室頂部配置30W可調(diào)白光LED光源，照度范圍0-1200lux；暗室配備30W紅色LED燈（波長620-750nm），底部照度恒定2lux。箱體內(nèi)部安裝紅外攝像系統(tǒng)，配備850nm紅外濾鏡及平行光源，采樣頻率30fps。行為分析軟件采用EthoVision XT 16，通過閾值分割與質(zhì)心追蹤技術(shù)提取行為參數(shù)。

 

二）實驗動物

SPF級昆明小鼠84只，雄性，6-8周齡，體重22±2g。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分組，每組6只。實驗遵循NIH動物福利指南，所有操作經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)（編號：SYXK-2022-001）。

（三）實驗設(shè)計

采用4×2析因設(shè)計，考察晝夜節(jié)律（白天18:00-6:00；黑夜6:00-18:00）、光照面積（大面積箱體3/5；小面積箱體2/5）兩因素對焦慮行為的主效應(yīng)及交互作用。光照顏色實驗設(shè)置黃、綠、藍、紅四種波長（λ=580nm、530nm、470nm、620nm），光照強度實驗采用15W、25W、40W、60W、100W梯度功率。每組實驗重復(fù)6次，每次測試時長5分鐘。

（四）行為參數(shù)采集

記錄以下核心指標(biāo)：①基礎(chǔ)行為：明暗箱停留時間百分比（Ltime%、Dtime%）、穿梭次數(shù)（Transition）、水平運動得分（Cross）、垂直運動得分（Rear）；②運動特征：總路程（Total Distance）、平均速度（Average Speed）、加速度（Acceleration）；③焦慮相關(guān)指標(biāo)：排便粒數(shù)（Fecal Pellets）、修飾次數(shù)（Grooming）。采用雙盲法進行數(shù)據(jù)采集與分析，實驗間隔期間使用75%乙醇徹底清潔箱體。

三、結(jié)果

（一）晝夜節(jié)律與光照面積交互作用

白天周期中，大箱組Ltime%（38.7±4.2% vs 32.1±3.8%）、Cross（12.4±1.8 vs 9.8±1.5）顯著高于小箱組（p<0.05），提示空間大小對日間探索行為具有放大效應(yīng)；夜間則呈現(xiàn)相反趨勢，小箱組Total Distance（823.6±98.7 cm vs 745.3±89.4 cm）和Rear（4.2±0.6 vs 3.5±0.5）顯著增加（p<0.05）。析因分析顯示晝夜節(jié)律與光照面積存在顯著交互作用（F=4.32, p=0.016）。

（二）光照顏色效應(yīng)

黃光組表現(xiàn)出獨特的焦慮樣表型：Ltime%（28.4±3.1%）顯著低于藍光組（35.6±4.2%），而Defecation（5.2±0.8 pellets）卻高于綠光組（3.8±0.6 pellets）。光譜分析表明，黃光波長（580-600nm）可能通過視網(wǎng)膜ipRGCs通路影響SCN核團活動，進而調(diào)節(jié)情緒相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)釋放。

（三）光照強度劑量效應(yīng)

在15-100W范圍內(nèi)，Cross次數(shù)呈現(xiàn)倒U型曲線，峰值出現(xiàn)在40W組（14.2±1.9次），低強度組（15W）和高強度組（100W）分別下降至9.6±1.3次和10.8±1.6次。這種非線性關(guān)系提示存在最佳刺激強度窗口，可能與視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機制有關(guān)。

四、討論

本研究首次系統(tǒng)揭示了晝夜節(jié)律與光照面積的交互作用機制，發(fā)現(xiàn)大空間在白天更能誘發(fā)焦慮樣行為，這與人類"幽閉恐懼癥"的空間認(rèn)知特性形成有趣對照。光照顏色的研究發(fā)現(xiàn)黃光具有獨特的焦慮誘導(dǎo)效應(yīng)，這為理解季節(jié)性情感障礙的光周期治療提供了新視角。光照強度的倒U型曲線證實了環(huán)境刺激的"金發(fā)姑娘原則"，過度刺激反而抑制行為表現(xiàn)。

實驗設(shè)計的創(chuàng)新點體現(xiàn)在三個方面：①采用析因設(shè)計全面解析多因素交互作用；②引入高精度紅外追蹤系統(tǒng)實現(xiàn)行為自動化分析；③構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化實驗流程提升結(jié)果可比性。這些改進有效降低了操作誤差，提高了數(shù)據(jù)可靠性。未來可結(jié)合光遺傳學(xué)技術(shù)進一步解析特定腦區(qū)在光照調(diào)控中的作用機制。

五、結(jié)論

明暗箱實驗的優(yōu)化需綜合考慮晝夜節(jié)律、光照參數(shù)等多維度因素。本研究表明：①白天使用大面積箱體更利于檢測焦慮樣行為；②黃光波長具有特異性焦慮誘導(dǎo)效應(yīng)；④40W光照強度為行為激發(fā)的最佳閾值。這些發(fā)現(xiàn)為建立標(biāo)準(zhǔn)化的焦慮模型提供了重要參考，同時也為臨床光療方案的制定提供了實驗依據(jù)。