摘要?
新生小鼠視網(wǎng)膜活體電轉化技術為視網(wǎng)膜發(fā)育及疾病研究提供關鍵手段。研究借助方波型電穿孔儀，優(yōu)化電轉化參數(shù)，實現(xiàn)外源基因在新生小鼠視網(wǎng)膜的高效遞送與表達，顯著提升轉染效率，為視網(wǎng)膜相關基礎研究及轉化醫(yī)學提供可靠技術平臺。?

引言?
視網(wǎng)膜作為視覺信號傳遞的關鍵組織，其發(fā)育機制及疾病發(fā)生機理的研究一直是眼科領域的熱點。新生小鼠視網(wǎng)膜處于快速發(fā)育階段，此時進行基因操作可有效研究基因在視網(wǎng)膜細胞分化、遷移及功能建立中的作用。然而，傳統(tǒng)的基因遞送方法在活體視網(wǎng)膜操作中存在效率低、細胞損傷大等問題，難以滿足精準科研需求。?
電轉化技術通過脈沖電場瞬時改變細胞膜通透性，使外源核酸等大分子進入細胞，在活體組織基因遞送中展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。方波型電穿孔儀憑借其先進的方波脈沖技術、智能監(jiān)控系統(tǒng)及靈活的參數(shù)設置，為新生小鼠視網(wǎng)膜活體電轉化提供了高效精準的解決方案，助力科研人員突破傳統(tǒng)技術瓶頸。?

材料與方法?
1. 實驗動物?
出生后 0-2 天（P0-P2）的 C57BL/6J 新生小鼠，由本實驗室 SPF 級動物房提供，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±2）℃，濕度 50%-60%，12 小時光照 / 黑暗循環(huán)。?

2. 主要試劑?
質粒 DNA（含目的基因 GFP，由本實驗室構建）、某試劑（用于配制電轉緩沖液，含 NaCl、KCl、葡萄糖等成分，pH 值調至 7.4）、麻醉劑（異氟烷，用于小鼠麻醉）、消毒試劑（75% 乙醇）。?

3. 主要儀器?
方波型電穿孔儀、體視顯微鏡（某品牌，用于手術操作觀察）、顯微注射針（外徑 10-15μm，用于質粒注射）、恒溫加熱板（維持小鼠體溫）。?

實驗步驟?
1. 小鼠麻醉與固定?
將新生小鼠置于含異氟烷的麻醉盒中，誘導麻醉后轉移至恒溫加熱板上，保持體溫穩(wěn)定。使用膠帶輕輕固定小鼠頭部及四肢，確保手術過程中小鼠體位穩(wěn)定。?

2. 視網(wǎng)膜定位與質粒注射?
在體視顯微鏡下，用微量上樣針吸取含目的基因的質粒 DNA（濃度為 1-2μg/μL），從小鼠眼球顳側角膜緣處進針，緩慢將針尖插入玻璃體腔，避開晶狀體，準確將 5-10μL 質粒溶液注射到視網(wǎng)膜下腔。注射過程中注意控制進針深度和速度，避免損傷視網(wǎng)膜組織。?

3. 電穿孔參數(shù)設置與操作?
方波型電穿孔儀采用預編程優(yōu)化系統(tǒng)，針對新生小鼠視網(wǎng)膜組織特點，選擇哺乳動物細胞轉染模式，調用內置的視網(wǎng)膜細胞推薦參數(shù)：方波脈沖，電壓根據(jù)小鼠年齡及眼球大小調整（一般為 50-80V），脈沖時長 10-20ms，脈沖次數(shù) 3-5 次，脈沖間隔 1-2s。?

將定制的鑷子型電極（電極間距 1-2mm，表面經(jīng)絕緣處理，避免電流泄漏）輕輕夾住小鼠眼球，確保電極與眼球表面緊密貼合，且不壓迫眼球。通過腳踏開關啟動電穿孔程序，儀器 10 英寸觸控屏實時顯示脈沖波形與參數(shù)動態(tài)，便于實驗者監(jiān)控整個過程。電穿孔過程中，儀器自動進行智能阻抗檢測，預脈沖測量樣品電阻，動態(tài)調整參數(shù)，確保每次電擊條件與視網(wǎng)膜細胞狀態(tài)完美匹配。同時，獨家的電弧防護與極性轉換技術杜絕了電弧損傷，突破細胞膜電荷屏障，提升難轉染細胞的成功率。?

4. 術后處理?
電轉操作完成后，將小鼠移回母鼠身邊，保持環(huán)境溫暖安靜。術后每天觀察小鼠眼部狀態(tài)及存活情況，確保無感染及其他并發(fā)癥發(fā)生。?

結果與討論?
轉染效率檢測?
在電轉后 3 天，取小鼠眼球，制備視網(wǎng)膜冰凍切片，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況。結果顯示，視網(wǎng)膜各層細胞均可見明顯的 GFP 熒光信號，尤其是神經(jīng)節(jié)細胞層、內核層和外核層，轉染效率較傳統(tǒng)方法提升超 40%（基于威尼德內部測試數(shù)據(jù)）。這得益于威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀的高強度電場瞬時重塑細胞膜通透性，實現(xiàn)了核酸大分子的高效遞送。?

細胞存活與組織損傷評估?
通過蘇木精 - 伊紅（HE）染色觀察視網(wǎng)膜組織結構，電轉組小鼠視網(wǎng)膜各層結構清晰，細胞排列整齊，與對照組相比，未出現(xiàn)明顯的細胞壞死或炎癥反應。臺盼藍排斥實驗顯示，電轉后視網(wǎng)膜細胞存活率達 90% 以上，表明該電轉化技術對視網(wǎng)膜組織損傷小，保證了后續(xù)實驗的可行性。?

與傳統(tǒng)技術對比優(yōu)勢?
 傳統(tǒng)的病毒載體轉染方法存在制備周期長、成本高、載體容量有限等問題，且可能引發(fā)免疫反應。而方波型電穿孔儀介導的活體電轉化技術，無需病毒包裝，可直接遞送 DNA、RNA 及蛋白質等大分子，操作簡便快捷，成本低，同時避免了病毒載體的潛在風險。其全波形智能監(jiān)控系統(tǒng)確保實驗過程透明可控，數(shù)據(jù)可追溯，助力科研結果的精準復現(xiàn)。預編程優(yōu)化系統(tǒng)內置常用細胞株參數(shù)庫，一鍵調用，同時支持自定義脈沖參數(shù)，適配新生小鼠視網(wǎng)膜等復雜場景，展現(xiàn)出強大的靈活性和適
用性。?

技術優(yōu)化與注意事項?
在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)電穿孔參數(shù)的優(yōu)化是影響轉染效率的關鍵因素。電壓過高或脈沖次數(shù)過多可能導致細胞損傷，而電壓過低則轉染效率不足。Gene Pulser 830 的智能阻抗檢測功能能夠根據(jù)樣品電阻動態(tài)調整參數(shù)，有效解決了這一問題。此外，注射質粒的濃度和體積、電極的貼合程度以及小鼠的日齡均會對實驗結果產(chǎn)生影響，需嚴格控制實驗條件。?

應用前景?
基礎研究領域?
該技術可廣泛應用于視網(wǎng)膜發(fā)育相關基因的功能研究，如 CRISPR 基因編輯技術結合電轉化，可實現(xiàn)視網(wǎng)膜特定基因的敲除或敲入，研究其在視網(wǎng)膜細胞分化、神經(jīng)環(huán)路形成中的作用；siRNA 遞送可用于抑制目標基因表達，探索基因在視網(wǎng)膜疾病發(fā)生中的機制；干細胞重編程研究中，電轉化技術可將重編程因子高效導入視網(wǎng)膜干細胞，為視網(wǎng)膜再生醫(yī)學研究提供新途徑。?

轉化醫(yī)學領域?
在活體腫瘤電轉方面，可針對視網(wǎng)膜母細胞瘤等眼部腫瘤，通過電轉化遞送治療性基因或藥物，實現(xiàn)精準靶向治療；疫苗開發(fā)中，電轉化技術可將抗原基因遞送至視網(wǎng)膜相關免疫細胞，誘導免疫反應，為眼部疫苗研究提供新思路；體內基因治療方面，對于遺傳性視網(wǎng)膜疾病，如色素性視網(wǎng)膜炎、先天性黑蒙癥等，電轉化技術可將正常基因導入視網(wǎng)膜細胞，為基因治療的臨床應用奠定基礎。?

農(nóng)業(yè)與工業(yè)領域?
雖然研究聚焦于新生小鼠視網(wǎng)膜，但方波型電穿孔儀的廣泛適用性使其在農(nóng)業(yè)與工業(yè)領域也具有巨大潛力。在植物遺傳改良中，可用于植物原生質體的基因遞送，加速農(nóng)作物品種改良；酵母工程菌構建及微生物代謝工程中，電轉化技術可高效實現(xiàn)外源基因導入，提高工程菌的生產(chǎn)效率。?

方波型電穿孔儀憑借其革新的方波脈沖技術、智能監(jiān)控系統(tǒng)及深度的技術服務支持，已成為超 500 家頂尖科研機構的信賴之選。無論是基礎研究中的精準基因操作，還是轉化醫(yī)學中的創(chuàng)新治療探索，該設備都為科研人員提供了高效可靠的技術平臺。目前，威尼德提供免費技術方案咨詢及產(chǎn)品試用服務，助力科研人員攻克轉染技術壁壘，推動生命科學研究及相關領域發(fā)展。

參考文獻
1. 氧誘導新生小鼠視網(wǎng)膜病變中血管新生和氧應激相關基因表達的變化 [J] . 余增洋 ,龔陳媛 ,張國慶 . 中國藥理學通報 . 2014,第010期
2. 單核細胞趨化蛋白-1在氧誘導視網(wǎng)膜病變新生小鼠模型中的表達 [J] . 董寧 ,褚利群 ,肖林 . 中華實驗眼科雜志 . 2012,第004期
3. 單核細胞趨化蛋白-1在氧誘導視網(wǎng)膜病變新生小鼠模型中的表達 [J] . 董寧 ,褚利群 ,肖林 . 中華實驗眼科雜志 . 2012,第004期
4. 新生小鼠視網(wǎng)膜組織中MCP-1的表達變化及意義 [J] . 董寧 ,褚利群 ,肖林 . 山東醫(yī)藥 . 2011,第026期
5. MMP-2在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變新生小鼠模型中的表達 [J] . 姜雙 ,陳曉隆 . 遼寧醫(yī)學院學報 . 2009,第006期