Section.02
鐵死亡檢測方法

檢測鐵死亡的方法包括檢測代謝反應 (如脂代謝，鐵代謝和 GSH 相關代謝) 相關標志物含量變化，細胞形態變化和分子蛋白含量/活性變化。

1. 過氧化脂質檢測

脂質過氧化是鐵死亡的核心驅動因素，過度的脂質過氧化通過產生有毒的磷脂氫過氧化物 (PLOOH)，在促進鐵死亡中起著重要作用，因此過氧化脂質可用于細胞鐵死亡的檢測。

在對骨關節炎中軟骨細胞鐵死亡的研究中，為了證實 SM@ApoFn nanocage 具有抑制細胞鐵死亡的功能，作者用脂溶性比率型熒光探針 BODIPY 581/591 C11 來評估細胞內脂質過氧化水平。如圖所示，BODIPY 581/591 C11 (10 μM) 探針分析 IL-1β 預處理 12 小時后，各組給予 SM04690、ApoFn 和 SM@ApoFn 處理 24 h 的軟骨細胞中細胞膜脂質的氧化和還原狀態，其中 SM@ApoFn 減輕 IL-1β 引起的脂質過氧化。

圖 2. 不同納米藥物處理的 HT-1080 細胞中的總 ROS 水平檢測^[2]。 
用 C11-BODIPY 和 DCFH-DA 熒光探針檢測不同納米藥物處理的 HT-1080 細胞內脂質過氧化和總 ROS。

3. 過氧化脂質衍生物檢測

脂質過氧化反應過程中，大量的脂質過氧化初級產物在氧化反應中逐漸分解為一系列復雜的醛類化合物，包括 MDA，4-HNE，丙醛和己醛等。這些活性醛類物質能夠攻擊蛋白質等生物大分子，形成加合物，從而引發細胞的進一步損傷。

在研究真核翻譯起始因子 EIF4E 通過控制脂質過氧化作為鐵死亡敏感性的決定因素的研究中。科研人員為了研究 4HNE 產量增加是否會影響反饋回路，從而降低細胞對鐵死亡的敏感性。結果表明，用 RSL3 處理后，ALDH1B1 的過表達限制了 WT 和 EIF4E 過表達的 Calu-1 細胞中 4HNE 的積累，這表明 ALDH1B1 在限制鐵死亡期間細胞中 4HNE 的產生方面仍然發揮著重要作用。

需要注意的是，MDA 和 4-HNE 在除鐵死亡外的多種氧化 應激狀態下均可產生，在實際應用中，一般與其他檢測方法進行相互驗證，以提高結果的可靠性和準確性。

圖 3. 用 RSL3（0.5 μM，4 小時）處理不同過表達體系的 Calu-1 細胞中 4HNE 染色的免疫熒光分析^[3]。

4. 鐵代謝相關生物標志物檢測

鐵死亡過程中，細胞內亞鐵離子的積累會導致氧化應激的增加，促進脂質過氧化。因此，細胞鐵含量或者 Fe²⁺/Fe³⁺ 比值的測定可作為鐵死亡監測的重要指標。FerroOrange 是一種特異性 Fe²⁺ 探針，與 Fe²⁺ 結合形成橙色熒光復合物，可通過熒光顯微鏡或流式細胞術檢測 (Ex/Em: 542/572 nm), 從而定量分析細胞內 Fe²⁺ 的濃度。

研究人員在明確 PGS（一種天然產物 P-L）對腎臟、智力及神經保護的潛在作用，探索 PGS 的確切靶點及作用機制。在研究 PGS 是否減輕缺氧 BV2 細胞脂質過氧化物積累引起的鐵死亡實驗中，使用 FerroOrange 染色，PGS 可減輕 BV2 細胞中缺氧 (HH) 誘導的鐵死亡。

圖 4. PGS (一種天然產物 P-L, 50 μg/mL; P-M, 100 μg/mL; P-H, 200 μg/mL) 可減輕 BV2 細胞中缺氧 (HH) 誘導的鐵死亡^[4]。

5. 谷胱甘肽代謝相關生物標志物檢測

谷胱甘肽 (GSH) 是細胞內主要的抗氧化劑，在鐵死亡過程中，GSH 水平顯著下降，導致抗氧化能力減弱， 進而促進脂質過氧化物的積累。因此，檢測 GSH 相關代謝等指標可用于監測鐵死亡的過程。

鐵死亡在腸缺血再灌注損傷中起著至關重要的作用，抑制鐵死亡可能為治療該疾病提供新的途徑，研究人員在對鐵死亡發生的小鼠腸道缺血再灌注模型中進行檢測，再灌注 30 min 后，組織中總鐵和 Fe²⁺ 含量最高，LPO 產物 MDA 也隨再灌注時間延長而積累，還原型 GSH 水平降低，氧化型 GSSG 水平升高。

圖 5. 小鼠腸道缺血再灌注模型中，再灌注 30 min 后使用 GSH?+?GSSG/GSH 檢測試劑盒評估腸道組織中谷胱甘肽、GSH、GSSG 和 GSH/GSSG 水平^[5]。

6. 細胞和亞細胞水平的形態學檢測

鐵死亡細胞的典型形態學特征包括質膜完整性喪失，細胞膜破裂，線粒體萎縮，線粒體外膜破裂、嵴減少或缺失、膜密度增加，可通過透射電子顯微鏡 (TEM) 檢測。此外，鐵死亡發生時，也伴隨著線粒體膜通透性增加和線粒體膜電位降低，內質網粘度增加和內質網應激， 以及溶酶體鐵或一氧化氮 (NO) 的累積。可借助相關熒光探針，用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。

在研究溴結構域蛋白 4（BRD4）抑制 Erastin 誘導的鐵死亡中，研究人員使測量了 BRD4 抑制前后細胞的氧化分解代謝，與 Erastin 處理組相比，當 BRD4 被其抑制劑 (+)-JQ1 和 PFI-1 抑制時，檢測到的線粒體膜電位低得多。

圖 6. Erastin (10 μM, 24 h) 誘導 HT1080 鐵死亡，JC-1 檢測線粒體膜電位變化^[6]。 

7. 調控鐵死亡的基因和蛋白的檢測

鐵死亡主要由鐵依賴性脂質過氧化引起，其調控機制包括多種，主要分為過氧化代謝部分 (如鐵代謝和脂代謝途徑) 和抗氧化部分 (如 System xc^--GSH-GPX4 途徑，AIFM2-CoQ10/GCH1-BH4/ ESCRT-III 和 DHODH 途徑)。鐵死亡發生時，一些關鍵基因和蛋白表達水平發生變化，因此，采用 Western blot / 免疫熒光 / 免疫組織化學 / 實時熒光定量 PCR 技術等方法來表征鐵死亡的發生。

在探討鐵死亡是否參與缺氧缺血性腦損傷及其機制的研究中，通過阻斷左頸總動脈建立 7 日齡雄性 Sprague-Dawley 新生大鼠 HIBD 模型。HIBD 組大鼠的活性氧水平顯著升高，鐵代謝相關蛋白轉鐵蛋白受體 (TFRC)、鐵蛋白重鏈 (FHC)、鐵蛋白輕鏈 (FLC) 的蛋白水平顯著升高，而 SLC7A11、GSH、GPX4 的蛋白水平降低，這些變化導致細胞抗氧化能力下降、線粒體損傷，引起大腦皮層神經元鐵死亡。

圖 7. 通過阻斷左頸總動脈建立 7 日齡雄性 Sprague-Dawley 新生大鼠 HIBD 模型后 72 小時腦組織中鐵死亡相關蛋白的水平^[7]。 

Section.03
小結

今天，小 M 給大家詳細介紹了鐵死亡的關鍵指標和對應的檢測方式，檢測指標也呈現出多樣化的特點。鐵死亡收到多條通路的調控，在實驗檢測過程中，各個通路相輔相成，互相影響，大家在檢測鐵死亡時，需要組合出擊，多種檢測方式共同驗證，實驗結果才會更有說服力哦。

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