固有免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線，在抗病毒免疫中發(fā)揮著重要作用。RNA病毒因其高變異性，常常引發(fā)致命的大流行病，對人類健康構(gòu)成重大威脅。固有免疫系統(tǒng)通過識(shí)別病原體的特異性分子模式，迅速啟動(dòng)免疫反應(yīng)，從而阻止病毒的進(jìn)一步擴(kuò)散。RIG-I（Retinoic Acid-Inducible Gene I）作為一種重要的胞質(zhì)RNA感受器，在識(shí)別病毒雙鏈RNA（dsRNA）后，能夠觸發(fā)抗病毒免疫應(yīng)答。然而，RIG-I的激活機(jī)制及其動(dòng)態(tài)調(diào)控過程仍存在許多未解之謎。近日，由浙江大學(xué)張龍教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，RIG-I分子間C864-C869二硫鍵的形成對于其相分離及其介導(dǎo)的抗病毒免疫應(yīng)答至關(guān)重要。此外，研究還開發(fā)了靶向穩(wěn)定或抑制RIG-I二硫鍵形成的干預(yù)策略，為抗病毒治療及自身免疫性疾病的治療提供了新的思路。這項(xiàng)研究成果于2025年4月發(fā)表在國際知名期刊《Nature Cell Biology》。
 

研究材料與方法
為了深入探究C864-C869分子間二硫鍵的形成在RIG-I介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答中的作用，本研究使用RIG-I分子間二硫鍵形成缺陷型基因敲入小鼠模型（Rig-I^C865S/C865S）進(jìn)行了小鼠水平的驗(yàn)證。該敲入小鼠模型由賽業(yè)生物公司通過CRISPR-Cas9 技術(shù)構(gòu)建。為了生成敲入后代，將針對小鼠Rig-I基因的gRNA、含有p.C865S（TGC至AGC）突變和一個(gè)同義突變p.S871=（AGC至TCT）的供體寡核苷酸以及Cas9 共同注射到受精卵中。

技術(shù)路線

質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)病毒刺激引起RIG-I分子間C864-C869二硫鍵的形成
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通過基因編輯技術(shù)構(gòu)建Knock-in小鼠，驗(yàn)證C864-C869二硫鍵的功能
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使用遺傳密碼拓展技術(shù)，在RIG-I C864位點(diǎn)引入非天然氨基酸，實(shí)現(xiàn)分子間二硫鍵的穩(wěn)定交聯(lián)
↓
開發(fā)靶向抑制RIG-I二硫鍵形成的干擾肽

研究結(jié)果
（1） RIG-I二硫鍵的鑒定與驗(yàn)證
研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)病毒刺激能夠誘導(dǎo)RIG-I分子間二硫鍵的形成。為了確定RIG-I分子間二硫鍵形成的位點(diǎn)，研究人員對有無SeV病毒刺激情況下的RIG-I進(jìn)行了質(zhì)譜分析。質(zhì)譜結(jié)果顯示，在SeV病毒刺激下，RIG-I蛋白分子間能夠形成C864-C869 位點(diǎn)的二硫鍵；而在沒有病毒刺激時(shí)，未檢測到分子間二硫鍵的形成。
 

圖1. RNA病毒刺激誘導(dǎo)RIG-I蛋白間形成C864-C869位點(diǎn)的分子間二硫鍵

（2）C864-C869分子間二硫鍵的形成對于RIG-I介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答至關(guān)重要
研究團(tuán)隊(duì)使用賽業(yè)生物公司提供的RIG-I分子間二硫鍵形成缺陷型基因敲入小鼠模型進(jìn)行了小鼠水平的驗(yàn)證。探究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：C865S點(diǎn)突變（對應(yīng)人C864S突變）導(dǎo)致RIG-I寡聚化和凝聚體形成缺陷，顯著抑制固有免疫反應(yīng)，使小鼠對VSV病毒感染的易感性增加并伴隨死亡率上升。
 

圖2. C864-C869分子間二硫鍵的形成對于RIG-I介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答至關(guān)重要

（3）靶向RIG-I C864-C869分子間二硫鍵以調(diào)控宿主抗病毒免疫應(yīng)答
研究人員開發(fā)了靶向穩(wěn)定或抑制RIG-I C864-C869二硫鍵形成的干預(yù)策略。通過遺傳密碼拓展技術(shù)，在RIG-I C864位點(diǎn)引入非天然氨基酸，實(shí)現(xiàn)了分子間二硫鍵的穩(wěn)定交聯(lián)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靶向穩(wěn)定RIG-I二硫鍵的形成可以顯著增強(qiáng)宿主抗病毒免疫應(yīng)答能力。同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，疾病相關(guān)的RIG-I病理突變（如C268F或E373A）或mtRNA泄漏至胞質(zhì)中均能導(dǎo)致RIG-I異常激活，從而引發(fā)異常的固有免疫應(yīng)答。RIG-I的病理突變或mtRNA引起的異常激活依賴于C864-C869位點(diǎn)的分子間二硫鍵形成。為此，該研究開發(fā)了靶向抑制RIG-I C864-C869分子間二硫鍵形成的干擾肽RIP-III。在相關(guān)細(xì)胞和小鼠模型中，RIP-III能夠有效抑制這些異常的RIG-I介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。

圖3. 靶向RIG-I C864-C869分子間二硫鍵以調(diào)控宿主抗病毒免疫應(yīng)答

總結(jié)
該項(xiàng)研究首次揭示了RIG-I在響應(yīng)RNA病毒感染時(shí)發(fā)生分子間二硫鍵這一過程。研究發(fā)現(xiàn)，RIG-I分子間C864-C869二硫鍵的形成對于其相分離及其介導(dǎo)的抗病毒免疫應(yīng)答至關(guān)重要。此外，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了靶向穩(wěn)定或抑制RIG-I二硫鍵形成的干預(yù)策略，為抗病毒治療及自身免疫性疾病的治療提供了新的思路。該項(xiàng)研究不僅為RIG-I的激活機(jī)制提供了更為深入的見解，還為開發(fā)針對RIG-I介導(dǎo)的相關(guān)疾病的臨床治療藥物奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。研究中使用的賽業(yè)OriCell?提供的動(dòng)物模型，為實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了重要支持。未來，基于RIG-I二硫鍵調(diào)控的抗病毒策略有望在臨床中得到廣泛應(yīng)用，為人類健康保駕護(hù)航。