鈣離子（Ca²⁺）作為生物體內(nèi)重要的第二信使，在眾多生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。從神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)到肌肉的收縮，從細(xì)胞的增殖與分化到激素的分泌，鈣離子都扮演著重要的角色。

Section.01
細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測(cè)方法

準(zhǔn)確地檢測(cè)和分析細(xì)胞內(nèi)或組織中的鈣離子濃度變化，對(duì)于深入理解各種生理和病理過程具有極其重要的意義^[1]。細(xì)胞內(nèi)鈣離子的常見檢測(cè)方法主要有鈣離子選擇性微電極測(cè)定法、同位素示蹤法、核磁共振法、熒光探針法等。

鈣離子選擇性微電極測(cè)定法在檢測(cè)過程中不需要使用指示劑，但在穿刺細(xì)胞時(shí)可能會(huì)造成損傷，進(jìn)而引發(fā)滲漏問題。同位素示蹤法雖然具有較高的靈敏度，卻對(duì)靜息狀態(tài)下的 Ca²⁺ 水平不敏感，并且存在一定的放射性影響。核磁共振法雖能在接近生理狀態(tài)下檢測(cè) Ca²⁺ 的變化，但其成本較高。相比之下，熒光探針法目前是檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子分布及變化情況的最廣泛應(yīng)用的方法。

Section.02
常見的鈣離子探針

自上個(gè)世紀(jì) Roger Tsien 團(tuán)隊(duì)開發(fā)出第一款鈣離子熒光探針以來^[2]，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，市場(chǎng)上出現(xiàn)了眾多種類的鈣離子探針，目前已有許多商業(yè)化的鈣離子探針。其中，最常用的鈣離子探針包括 Fluo-4 AM、Fluo-3 AM、Rhod-2 AM 和 Fura-2 AM 等。接下來，讓我們逐一探討這些鈣離子探針的具體應(yīng)用。

常用的 Ca²⁺ 熒光探針根據(jù)波長(zhǎng)的不同，分為可見光激發(fā) Ca²⁺ 熒光探針和紫外光激發(fā) Ca²⁺ 熒光探針兩大類。

可見光激發(fā) Ca²⁺ 熒光探針

與紫外光激發(fā)的熒光探針相比，可見光激發(fā) Ca²⁺ 探針具有以下特點(diǎn)：

1）適用于大多數(shù)的激光共聚焦測(cè)鈣系統(tǒng)，包括共聚焦激發(fā)掃描顯微鏡以及流式細(xì)胞儀等。
2）具有更強(qiáng)的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測(cè)  Ca²⁺ 變化，從而降低了對(duì)活細(xì)胞的光毒性。
3）Ca²⁺ 依賴性熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，對(duì) Ca²⁺ 變化水平檢測(cè)敏感度更高。
4）降低樣品自熒光以及光散射的干擾。
5）兼容光激活探針以及 UV- 激發(fā)試劑，因此更方便于多參數(shù)檢測(cè)。
6）無光譜偏移。

Fluo-3, AM

Fluo-3, AM (HY-D0716) 是一種常用的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光探針。它穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成 Fluo-3，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。Fluo-3 游離配體幾乎是非熒光性的，但與鈣離子結(jié)合后熒光顯著增強(qiáng)，熒光增加可達(dá) 60 至 80 倍。激發(fā)波長(zhǎng)為 506 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 526 nm。實(shí)際檢測(cè)時(shí)推薦使用的激發(fā)波長(zhǎng)為 488 nm 左右，發(fā)射波長(zhǎng)為 525～530 nm。

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MBP 處理降低了 Ca²⁺ 信號(hào)傳導(dǎo)，此現(xiàn)象可以被 XBP1 敲低逆轉(zhuǎn)。

 

 

圖 1. 使用 Fluo-3AM 染料測(cè)量神經(jīng)元 Ca²⁺ 信號(hào)^[3]。
EtOH ：溶劑對(duì)照；MBP：鄰苯二甲酸單丁酯。

Fluo-4, AM

Fluo-4 AM (HY-101896) 是 Fluo-3, AM? 的升級(jí)版，熒光比 Fluo-3 更亮。Fluo-4, AM 分子上的兩個(gè)氯原子被氟取代，這種結(jié)構(gòu)上的微小變化其可以加載更快并且在相同條件下熒光更加明亮。它同樣可以穿透細(xì)胞膜并在細(xì)胞內(nèi)被酯酶剪切形成 Fluo-4。Fluo-4 的激發(fā)波長(zhǎng)為 494 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 516 nm。Fluo-4, AM 適用于熒光顯微鏡和熒光酶標(biāo)儀等檢測(cè)手段。

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檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，US + MBs 處理使永生化人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 (HCMEC/D3) 細(xì)胞質(zhì)中的 Ca²⁺ 水平上升，同時(shí)這種現(xiàn)象可以被抗壞血酸拮抗。

 

圖 2. 通過 Fluo-4, AM 熒光探針檢測(cè)細(xì)胞中的 Ca²⁺ 信號(hào)^[4]。
US + MBs:超聲和微泡處理；AA：抗壞血酸

Rhod-2 AM

Rhod-2 AM (HY-D0989), 羅丹明 123 (Rhodamine 123, Rh-123)  的行生產(chǎn)物，是一種高親和力的可見光激發(fā)波長(zhǎng) Ca²⁺ 熒光探針，波長(zhǎng)明顯長(zhǎng)于 Fluo-3 或 Fluo-4，其與 Ca²⁺ 結(jié)合后的大激發(fā)波長(zhǎng)為 550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 578 nm，此探針更適用于具有高水平自熒光信號(hào)的細(xì)胞或組織 Ca²⁺ 水平檢測(cè)，也可用來檢測(cè)由光感受器和籠鎖鈣離子螯合劑光激活導(dǎo)致的鈣離子釋放。同時(shí)由于其正電荷特性，會(huì)特異性聚集在線粒體里，由此可以與 Rhodamine 123 聯(lián)合使用用于測(cè)定線粒體內(nèi)鈣離子水平。 

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Rh-123 的綠色熒光表示線粒體正常，其強(qiáng)度隨膜損傷而降低，而 Rhod-2 AM 的紅色熒光表示線粒體 Ca²⁺ 水平，發(fā)現(xiàn)經(jīng) F/G/H-GNC 處理的細(xì)胞熒光從綠色變?yōu)榧t色，表明線粒體完整性受損，鈣穩(wěn)態(tài)被破壞。

圖 3. Rh - 123 和 Rhod-2 AM 對(duì) 4T1 細(xì)胞進(jìn)行線粒體內(nèi)鈣離子水平檢測(cè)^[5]。
F/G/H-GNC：CL 供體 (魯米諾) 和受體 (TMPyP4) 通過 pH 依賴性拆卸/重組方法加載到 AFn 中，然后礦化 AFn 形成 FLC。隨后，使用界面限制溶膠-凝膠法將 FLC、GOx 和 Hb 定量共封裝在納米反應(yīng)器內(nèi)。為了能夠按需激活催化活性，最后使用 AS1411 混合物覆蓋納米反應(yīng)器，形成的三種 DNA 開關(guān)。

Mag-Fluo-4 AM

Mag-Fluo-4 AM (HY-D1498) 是一種 Fluo-4 的類似物，具有獨(dú)特的鈣和鎂離子檢測(cè)特性。它對(duì) Mg²⁺ 的結(jié)合親和力（Kd）為 4.7 mM，而對(duì) Ca²⁺ 的 Kd 為 22 μM，因此可以用作細(xì)胞內(nèi)鎂離子的指示劑以及低親和力的鈣離子指示劑。

Mag-Fluo-4 AM 染料能夠特異性地被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)捕獲，因此非常適合檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)游離鈣離子濃度的變化。在熒光酶標(biāo)儀下，Mag-Fluo-4 AM 的激發(fā)波長(zhǎng)為 490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 525 nm。

紫外光激發(fā) Ca²⁺ 熒光探針

Fura-2 AM 和 Indo-1 AM 均屬于可見光激發(fā)的鈣離子熒光指示劑，是目前常用的比率測(cè)量熒光探針。

1）與第一代染料 Quin-2 相比，F(xiàn)ura-2 和 Indo-1 具有更強(qiáng)的熒光發(fā)射，并且在生理 pH 范圍內(nèi)對(duì) pH 變化不敏感。這一特性使得它們?cè)诙喾N實(shí)驗(yàn)條件下仍能保持穩(wěn)定的讀數(shù)。
2）Fura-2 和 Indo-1 對(duì)鈣離子 (Ca²⁺) 具有更高的選擇性，相比于二價(jià)金屬離子如鎂 (Mg²⁺)、鋅 (Zn²⁺)、錳 (Mn²⁺)、鐵 (Fe²⁺) 等，它們對(duì) Ca²⁺ 的親和力更強(qiáng)。
3）作為雙波長(zhǎng)熒光染料，F(xiàn)ura-2 和 Indo-1 在標(biāo)定 Ca²⁺ 濃度時(shí)并不僅僅依賴于熒光強(qiáng)度的變化，而是通過比較不同波長(zhǎng)下的熒光比率來實(shí)現(xiàn)。這一比率測(cè)量的方法大大提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

Fura-2 AM

Fura-2 AM (HY-101897)  是紫外光激發(fā)的比值型或雙波長(zhǎng)熒光染料，其激發(fā)特性與 Ca²⁺ 濃度有關(guān)，當(dāng)介質(zhì)中沒有 Ca²⁺ 時(shí)，其激發(fā)峰為  380 nm，當(dāng)與鈣結(jié)合時(shí)，激發(fā)峰向短波方向 340 nm 處移動(dòng)，最后分別以 340 nm、380 nm 激發(fā)得到發(fā)射光的比例，這種比例與細(xì)胞內(nèi)  Ca²⁺ 濃度成正比例的關(guān)系。發(fā)射光譜在 530 nm 處測(cè)量^[6]。

比率型熒光探針減少了染料負(fù)載導(dǎo)致的指示不均勻、不良的染料保留和光漂白的影響。另外 Fura-2 還具有較強(qiáng)的抗熒光淬滅能力，在熒光顯微鏡或其它熒光檢測(cè)設(shè)備上可以連續(xù)檢測(cè)較長(zhǎng)時(shí)間，也不會(huì)明顯影響其熒光效果。

圖 4. 發(fā)射光譜在 530 nm 處測(cè)量不同鈣離子濃度時(shí) Fura-2 的激發(fā)光譜的情況^[6]。

Section.03
實(shí)驗(yàn)小貼士

 

為什么許多熒光探針會(huì)提供 R-AM/R 的形式?

以 Fluo-4 或 Fluo-4 AM 為例，常規(guī)的熒光探針如 Fluo-4 本身是一種極性較大的酸性化合物，無法直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。如果需要進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，通常需要借助膜片微電極 (patch PIpette)、顯微注射 (microinjection) 或胞引作用等方法來輔助藥物的加載，這些過程往往繁瑣且復(fù)雜。

為了解決這一問題，F(xiàn)luo-4 的負(fù)性基團(tuán)上結(jié)合了乙酰氧甲酯 (AM)。這一簡(jiǎn)單的化學(xué)改造不僅提高了其脂溶性，還消除了負(fù)電荷，從而顯著增強(qiáng)了其細(xì)胞滲透性。研究者只需將細(xì)胞孵育在含有 Fluo-4 AM 的培養(yǎng)液中，就可以輕松實(shí)現(xiàn)探針的加載，省去了許多麻煩的步驟。

一旦 Fluo-4 AM 進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的酯酶會(huì)對(duì)其進(jìn)行水解，恢復(fù)為 Fluo-4 形式，使其能夠在細(xì)胞內(nèi)正常發(fā)揮生理功能。通過這種方法，熒光探針的應(yīng)用變得更為簡(jiǎn)便與高效。

檢測(cè)鈣離子時(shí)，是否需要加入丙磺舒?

丙磺舒 (Probenecid) 是一種細(xì)胞膜中有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑。當(dāng)帶有AM基團(tuán)的鈣離子熒光探針進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成帶負(fù)電荷的形式，準(zhǔn)備與鈣離子結(jié)合。然而，一些細(xì)胞系中存在陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這些蛋白會(huì)將已經(jīng)轉(zhuǎn)化為負(fù)電荷形式的鈣離子熒光探針運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜外。當(dāng)加入丙磺舒后，它會(huì)抑制這些陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，從而防止探針的外泄，使得探針能夠在細(xì)胞內(nèi)充分發(fā)揮作用達(dá)到百分之百的效能。

鈣離子的熒光探針可以用于植物細(xì)胞嗎?

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，鈣離子探針可以用于植物，在植物中比較常用的是 Fluo-4^[7][8]。具體的方案方法可以參考文獻(xiàn)。

此外，熒光染料在保存、實(shí)驗(yàn)的過程中需要注意避光操作。配制好的染色工作液必須一次使用完畢，不能凍存喔~

好啦！本期分享就到這里，有需要的小伙伴自行點(diǎn)贊收藏~

 

 

產(chǎn)品推薦

Fluo-3 AM (HY-D0716) 常見的細(xì)胞質(zhì) Ca2+ 探針

Fluo-4, AM (HY-101896) 常見的細(xì)胞質(zhì) Ca2+ 探針，是 Fluo-3 AM 的升級(jí)版

Rhod-2 AM (HY-D0989) 線粒體 Ca2+ 探針

Mag-Fluo-4 AM (HY-D1498) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Ca2+ 探針

Fura-2 AM (HY-101897) 常見的比率型細(xì)胞質(zhì) Ca2+ 探針

丙磺舒 (HY-B0545) 有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑

氯化乙酰膽堿  (HY-B0282) 膽堿能 (cholinergic) 激動(dòng)劑,可引起細(xì)胞外的 Ca2+ 內(nèi)流

 

[1] Eisner D, et al. Physiology of intracellular calcium buffering [published correction appears in Physiol Rev. 2024 Jan 1;104(1):327. 
[2] Kao JP, et al. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3. J Biol Chem. 1989 May 15;264(14):8179-84. PMID: 2498309.
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[4] Chen J, et al. Enhanced macromolecular substance extravasation through the blood-brAIn barrier via acoustic bubble-cell interactions. Ultrason Sonochem. 2024;103:106768. 
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[8] Wang Y, et al. Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis root hairs. BMC Plant Biol. 2010 Mar 24;10:53.