Class I PI3Ks activate stretch-induced autophagy in trabecular meshwork cells

Keywords: Autophagy; Glaucoma; Mechanical stress; PI3K; Primary cilia; Trabecular meshwork.

眼壓升高（IOP）是青光眼的主要危險(xiǎn)因素，其是由于房水（AH）通過(guò)小梁網(wǎng)（TM）/施萊姆管（SC）流出通道組織的引流障礙，導(dǎo)致眼壓穩(wěn)態(tài)中斷。流出通道中的細(xì)胞持續(xù)受到機(jī)械力的影響，如拉伸應(yīng)力和剪切應(yīng)力，分別是由 IOP 和 AH 流量的每日波動(dòng)引起。研究表明，TM 和 SC 細(xì)胞能夠通過(guò)各種生理反應(yīng)感知和響應(yīng)這些機(jī)械應(yīng)力，這被認(rèn)為是維持 IOP 穩(wěn)態(tài)所必需的內(nèi)在適應(yīng)機(jī)制。

自噬的激活是一種適應(yīng)性反應(yīng)，初級(jí)纖毛（PC）是拉伸和剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 TM 和 SC 細(xì)胞中自噬的關(guān)鍵機(jī)械傳感器。初級(jí)纖毛作為細(xì)胞的信號(hào)樞紐，參與多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究發(fā)現(xiàn)，PC 依賴性拉伸誘導(dǎo)的自噬是由人 TM（HTM）細(xì)胞中 AKT 和 SMAD2/3 信號(hào)之間的一種新型相互激活機(jī)制介導(dǎo)的。然而，上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組件仍然難以捉摸。

磷酸磷脂酰肌醇（PIPs）是在真核細(xì)胞膜中發(fā)現(xiàn)的必需磷脂，是各種細(xì)胞過(guò)程中膜蛋白的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，包括自噬。PIPs 由磷脂酰肌醇（PI）的第3、第4 和第5 位磷酸化產(chǎn)生，有7 種不同的 PIPs 衍生物。在第三位磷酸化的 PIPs [PI（3）P、PI（3,5）P2 和 PI（3,4,5）P3] 參與自噬誘導(dǎo)和吞噬泡的形成。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）是一種可使PI環(huán)上第3 位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，其結(jié)構(gòu)可分為3 種類型（I 類、II 類和 III 類）。研究表明，I 類 PI3K 調(diào)節(jié) AKT 和 SMAD2/3 信號(hào)，并促進(jìn)剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 SC 細(xì)胞自噬。

最近，在美國(guó)杜克大學(xué)眼科中心及斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院眼科團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，探索了 PI3Ks 和 PIPs 作為上游信號(hào)成分在機(jī)械拉伸的 HTM 細(xì)胞中 PC 依賴性自噬激活中的作用，研究首次報(bào)道了 PIK3CA-INPP4A/B 參與機(jī)械應(yīng)力下的自噬激活以及 PIK3CA 在 PC 上的定位。研究成果發(fā)表于 Cellular and Molecular Life Sciences 期刊題為“Class I PI3Ks activate stretch-induced autophagy in trabecular meshwork cells”。

為了研究 I 類 PI3Ks 是否構(gòu)成響應(yīng)機(jī)械拉伸 TM 細(xì)胞中介導(dǎo)自噬激活的上游成分，首先分析了 PI3K 家族所有不同成員的催化亞基的 mRNA 表達(dá)水平。利用針對(duì)流出通道的單細(xì)胞 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn) TM 細(xì)胞中 PI3Ks 催化亞基的 5 種亞型在 mRNA 水平上顯著表達(dá)：IA 類 [PIK3CA（11.82%）、B（5.76%）和 D （3.75%）]、II 類 [PIK3C2A（18.59%）] 和 III 類 [PIK3C3（14.27%）]。

使用 PIK-75 對(duì) I 類 PI3Ks 進(jìn)行藥理學(xué)抑制，濃度遞增的 PIK-75（20 nM-2 μM）處理 HTM 細(xì)胞，隨后應(yīng)用循環(huán)機(jī)械拉伸（CMS，20% 或 8%應(yīng)變，1 Hz）。2 μM 的 PIK-75 處理完全降低了 CMS 誘導(dǎo)的 LC3 II 水平升高（圖1 A）。

最近一項(xiàng)關(guān)于造血干細(xì)胞的研究表明，PIK3CA、B 和 D 一起缺失，而不是單獨(dú)或成對(duì)缺失，會(huì)破壞自噬。為了研究這種可能性，使用針對(duì) PIK3CA、B 和 D 的 siRNA 對(duì) IA 類 PI3Ks 的催化亞基進(jìn)行單次或三次敲低，并評(píng)估機(jī)械拉伸細(xì)胞中的 LC3 II 水平。WB 分析顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，經(jīng)三重敲低的細(xì)胞中 CMS 誘導(dǎo)的 LC3 II 顯著降低（圖1 B）。與先前在造血干細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)一致，每個(gè)基因的單次敲除并不能阻止CMS誘導(dǎo)的LC3 II水平增加。

進(jìn)一步研究證實(shí)，在用表達(dá) RFP-GFP-LC3（Ad-tfLC3）的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的 HTM 細(xì)胞中抑制 I 類 PI3Ks 可防止 CMS 誘導(dǎo)的自噬體形成。與之前的研究一致，在 2 μM PIK-75 處理的CMS 刺激細(xì)胞中觀察到自噬數(shù)據(jù)（自噬體：黃色點(diǎn)；自噬溶酶體：紅色點(diǎn)）有質(zhì)的增加（圖1 C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，I 類 PI3K 催化亞基通過(guò)促進(jìn)自噬體的形成在調(diào)節(jié) CMS 誘導(dǎo)的自噬中發(fā)揮作用。

圖1 抑制 IA 類 PI3Ks 可防止 CMS 誘導(dǎo)的 HTM 細(xì)胞自噬。

接下來(lái)，研究了 II 類和 III 類 PI3K 是否也有助于 TM 細(xì)胞中拉伸誘導(dǎo)的自噬激活。為此，沉默了 HTM 細(xì)胞中 PIK3C2A 的表達(dá)，并評(píng)估了 CMS 后的 LC3 II 水平，發(fā)現(xiàn)PIK3C2A敲低并不能阻止CMS 作用下TM 細(xì)胞中 LC3 II 的增加。此外，III 類 PI3K（PIK3C3）的敲低并未抑制 CMS 誘導(dǎo)的 TM 細(xì)胞自噬激活。這些結(jié)果表明，II 類 PI3Ks 和 III 類 PI3Ks 均未顯著促進(jìn) TM 細(xì)胞中拉伸誘導(dǎo)的自噬激活。

進(jìn)一步研究 I 類 PI3Ks 在 HTM 細(xì)胞中 PC 上的定位。研究人員專注于 IA 類 PI3Ks（PIK3CA、PIK3CB 和 PIK3D），因?yàn)樗鼈兪?TM 細(xì)胞中表達(dá)最強(qiáng)烈的亞型。使用針對(duì)每種 I 類 PI3K 亞型的催化亞基的抗體以及乙酰化 TUBA4A（Ac-TUBA4A（一種 PC 標(biāo)志物）進(jìn)行免疫共染色。結(jié)果顯示，PIK3CB 或 PIK3CD 在 PC 上沒(méi)有顯著的共定位。相比之下，PIK3CA 與 PC 表現(xiàn)出很強(qiáng)的共定位性（圖2 A）。有趣的是，在暴露于循環(huán)機(jī)械拉伸的細(xì)胞中，PC 上 PIK3CA 的強(qiáng)度水平顯著降低（圖2 B）。這些結(jié)果表明，PIK3CA 定位于 PC 上，并在 CMS 處理的 HTM 細(xì)胞中與 PC 解離。

圖2 PIK3CA 在 PC 上的定位及其在CMS 處理的 HTM 細(xì)胞中與 PC 的解離。

上述結(jié)果表明，I 類 PI3Ks 在 CMS 誘導(dǎo)的自噬中的作用。據(jù)報(bào)道，I 類 PI3Ks 與 PI 磷酸酶活性相結(jié)合，為 T 細(xì)胞中自噬的啟動(dòng)提供 PI（3）P。因此，研究了由 I 類 PI3Ks 和 PI 磷酸酶產(chǎn)生的 PI（3）P 是否參與 CMS 誘導(dǎo)的 TM 細(xì)胞自噬。

首先，研究了 I 類 PI3Ks 參與 PC 的 PI（3）P 產(chǎn)生情況。為此，敲低所有三種 IA 類 PI3Ks（PIK3CA、PIK3CB 和 PIK3CD）的表達(dá)，并對(duì) PI（3）P 和 PC 標(biāo)志物 ARL13B 進(jìn)行共免疫染色，發(fā)現(xiàn)在 PC 和胞質(zhì)囊泡內(nèi)觀察到 PI（3）P 染色（圖3 A）。正如預(yù)期的那樣，I 類 PI3K 活性降低的細(xì)胞表現(xiàn)出 PI（3）P 染色的整體降低。定量分析證實(shí)，在 I 類 PI3K 敲低后，PC 處的 PI（3）P 水平顯著降低，支持 I 類 PI3Ks 在纖毛 PI（3）P 產(chǎn)生中的作用（圖3 B）。值得注意的是，在機(jī)械拉伸的細(xì)胞中未觀察到 PC 上 PI（3）P 產(chǎn)生的顯著差異。

圖3 PIK3CA、B 和 D 的三重敲低降低了 HTM 細(xì)胞中 PC 上 PI（3）P 的強(qiáng)度。

I 類 PI3Ks 主要產(chǎn)生 PI（3,4）P2 和 PIP3，然后轉(zhuǎn)化為 PI（3）P。PI（3,4）P2 和 PIP3 都與 AKT 的普列克底物蛋白同源（PH）結(jié)構(gòu)域結(jié)合。為了檢測(cè) PI（3,4）P2 或 PIP3，使用生物傳感器質(zhì)粒AKT-PH-GFP 轉(zhuǎn)染 HTM 細(xì)胞并進(jìn)行 CMS 處理。有趣的是，共聚焦顯微鏡顯示在質(zhì)膜上檢測(cè)到 AKT-PH-GFP 信號(hào)，并在細(xì)胞內(nèi)囊泡中積累（圖4 A）。響應(yīng) CMS 后，每個(gè)細(xì)胞的 AKT-PH-GFP 陽(yáng)性囊泡數(shù)量顯著增加（圖4 A）。共免疫染色進(jìn)一步揭示了這些囊泡與網(wǎng)格蛋白重鏈（CLTC）的部分共定位（圖4 B），表明囊泡是通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞過(guò)程形成的。

最后，實(shí)驗(yàn)旨在確定 I 類 PI3K（PIP3 或 PI（3,4）P2）產(chǎn)生的哪些 PIPs 轉(zhuǎn)化為 PI（3）P 以在 CMS 下啟動(dòng)吞噬泡的形成，以及與之相關(guān)的磷酸酶。為此，使用 siRNA 對(duì) SHIP1 和 SHIP2（介導(dǎo) PIP3 轉(zhuǎn)化為 PI（3,4）P2的5’ PI 磷酸酶）或 INPP4A 和 INPP4B（介導(dǎo) PI（3,4）P2 轉(zhuǎn)化為 PI（3）P的 4' PI 磷酸酶）進(jìn)行了雙重敲低，并進(jìn)行 CMS 測(cè)量 LC3 II 水平。結(jié)果顯示，敲低 INPP4A/B ，但不是 SHIP1/2，顯著降低了 TM 細(xì)胞中 CMS 誘導(dǎo)的 LC3 II 增加（圖4 C）。此外，使用 AS1949490 對(duì) SHIP1/2 進(jìn)行化學(xué)抑制，在濃度遞增的情況下，并沒(méi)有降低 CMS 誘導(dǎo)的 LC3 II 水平。共定位研究 AKT-PH-GFP 和 LC3 標(biāo)記點(diǎn)之間的部分共定位或接觸，表明 I 類 PI3Ks 產(chǎn)生的 PIPs 可能有助于自噬體的生物發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)表明，I 類 PI3Ks 與 INPP4 磷酸酶一起在 CMS 誘導(dǎo)的TM 細(xì)胞自噬中起直接作用。

圖4 在 HTM 細(xì)胞 CMS 期間 PI（3,4）P2 陽(yáng)性囊泡對(duì)自噬的調(diào)節(jié)。

總之，該研究首次描述了 PIK3CA-INPP4A/B 在機(jī)械應(yīng)力下自噬激活中的作用以及 PIK3CA 在 PC 上的定位。未來(lái)需要進(jìn)一步的研究來(lái)了解哪些 IA 類 PI3Ks 調(diào)節(jié)自噬降解的機(jī)制，以及通過(guò)機(jī)械力調(diào)節(jié) IA 類 PI3K 激活的上游信號(hào)。在 TM 機(jī)械感覺(jué)中具有已知功能的強(qiáng)候選者是整合素和 G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）。了解青光眼中的這些通路及其潛在改變，包括 I 類 PI3K 的改變，可以提供新的治療策略來(lái)恢復(fù) IOP 穩(wěn)態(tài)。

參考文獻(xiàn)：Shim MS, Sim EJ, Betsch K, Desikan V, Su CC, Pastor-Valverde D, Sun Y, Liton PB. Class I PI3Ks activate stretch-induced autophagy in trabecular meshwork cells. Cell Mol Life Sci. 2025 Feb 22;82(1):82. doi: 10.1007/s00018-025-05615-x. PMID: 39985671; PMCID: PMC11846827.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39985671/

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