輔酶Q ₁₀ (CoQ ₁₀ )檢測試劑盒( 微板法 )使用說明書
一、產品簡介：
輔酶Q(CoenzymeQ，CoQ)是一種生物體內廣泛存在的脂溶性醌類化合物，故又稱泛醌，在體內呼吸鏈中質子移位及電子傳遞中起重要作用，是呼吸鏈中重要的遞氫體，它是細胞呼吸和細胞代謝的激活劑，也是重要的抗氧化劑和非特異性免疫增強劑。對多種酶有激活作用。不同生物體來源的輔酶Q其側鏈異戊烯單位的數目不同，人類和哺乳動物是10個異戊烯單位，故稱輔酶Q ₁₀。輔酶Q ₁₀是輔酶Q類的重要成員之一，它們與線粒體內膜相結合，廣泛參與體內的生物代謝過程。輔酶Q ₁₀不僅能給心臟提供動力，還具有卓越的抗氧化，清除自由基功能，能預防血管壁脂質過氧化，預防動脈粥樣硬化，并且無任何毒副作用。具體作用體現在以下四個方面：
①幫助保護心臟輔酶Q ₁₀有助于為心肌提供充足氧氣，預防突發性心臟病，尤其在心肌缺氧過程中輔酶Q ₁₀發揮關鍵性改善作用。
②保護皮膚長期使用輔酶Q ₁₀能夠有效防止皮膚衰老，減少臉部皺紋。
③抗疲勞輔酶Q ₁₀使細胞保持良好健康的狀態，因而機體充滿活力，精力旺盛，腦力充沛。它是細胞自身產生的天然抗氧化劑和細胞代謝啟動劑，具有保護和恢復生物膜結構的完整性、穩定膜電位作用，是機體的非特異性免疫增強劑，因此顯示出極好抗疲勞作用。
④防癌抗癌研究表明，輔酶Q ₁₀有抗腫瘤作用，臨床對于晚期轉移性癌癥有一定療效。
雅吉生物輔酶Q ₁₀(CoQ ₁₀)檢測試劑盒(比色法)其檢測原理是待測樣品在堿性條件下，EC取代了CoQ ₁₀上的甲氰基，形成藍色化合物，通過分光光度計或酶標儀測定620nm處吸光度值，根據標準曲線即可測出輔酶Q ₁₀的含量。本產品可用于測定花生、牛肉、沙丁魚、保健品等食品中的CoQ ₁₀的含量。該試劑盒僅用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。
 
二、產品組成：

名稱規格	100T	存儲
試劑(A):CoQ10標準(5mg/ml)	0.1ml	-20℃避光
試劑(B):EC solution	5ml	RT避光
試劑(C):EC buffer	25ml	RT
試劑(D):CoQ10 Assay buffer	5ml	RT
使用說明書	一份

 
三、自備材料：
1、無水乙醇、蒸餾水、三氯甲烷或正己烷等提取試劑
2、比色杯或96孔板
3、分光光度計或酶標儀
 
四、 操作步驟(僅供參考)：
1、稀釋標準品：用EC buffer稀釋CoQ10標準(5mg/ml)至0.5mg/ml，-20℃保存備用。
2、準備樣品：
①新鮮動物心臟或肝臟樣品：用醇堿皂化法、溶劑皂化法等提取適量的CoQ10提取液，-20℃保存備用。（方法見附件二）
②動物血清樣品：0.1ml血清加入0.9ml三氯甲烷，持續搖動30min 以上，使CoQ10充分提取出來。如果檢測結果較低，可以降低三氯甲烷的加入量。
③保健食品：參考GB/T 22252-2008《保健食品中輔酶Q10的測定》中樣本的提取方法。具體如下：根據試樣中CoQ10含量，稱取1~5g 均勻試樣(精確至0.001g)，置于25ml棕色容量瓶中，加正己烷20ml，超聲提取20min后，加正己烷至刻度，搖勻，量取1.0ml上述溶液于10ml棕色容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，混勻，0.45um濾膜過濾，濾液備用。
④酵母菌等發酵菌體樣品：用醇堿皂化法提取，提取方法參考如下:
將濕菌體移入150ml 圓底燒瓶，加入0.7g焦性沒食子酸、2.5g氫氧化鉀、19ml甲醇和7ml蒸餾水，混勻。90℃水浴鍋中回流30min，迅速冷卻至室溫，倒入分液漏斗中，加入石油醚(正己烷、三氯甲烷或丙酮)等有機溶劑40ml，劇烈震蕩5min，萃取CoQ10，連續萃取2次，合并萃取液，用蒸餾水洗滌至中性，加入5g無水硫酸鈉干燥。用旋轉蒸發儀50℃濃縮至濃稠液，加入10ml無水乙醇，放入冰箱冷凍析出膽固醇等雜質，過濾，濾液定容至100m待用。
⑤細胞樣本：取一定數量的細胞加入生理鹽水或者PBS，用勻漿器勻漿或超聲破碎處理，高速離心，留取上清。后續參考血清樣品操作處理。
3、CoQ10加樣:按照下表設置空白、標準和測定，溶液應按照順序依次加入，并注意避免產生氣泡。如果樣品中的CoQ10濃度過高，可適當減少樣品用量或用EC buffer稀釋后再進行測定。
 

普通分光光度計(2ml比色杯)CoQ10測定
加入物(ml)	空白管	標準管	測定管
EC buffer	2	1.75	1.75
CoQ10標準(0.5mg/ml)	—	0.25	—
待測樣品(提取液)	—	—	0.25
EC solution	0.5	0.5	0.5
CoQ10  Assay buffer	0.5	0.5	0.5

 

酶標儀CoQ10測定
加入物(μl)	空白孔	標準孔	待測孔
EC buffer	200	175	175
CoQ10標準(0.5mg/ml)	-	25	-
待測樣品(提取液)	-	-	25
EC solution	50	50	50
CoQ10  Assay buffer	50	50	50

  4、CoQ ₁₀測定：混勻，室溫避光孵育3~5min，以空白管調零，比色杯光徑1cm，分光光度計或酶標儀620nm（600~640nm亦可）處測定標準管或測定管的吸光度。
 
計算：
液體樣品輔酶Q10濃度：CoQ10(mg/ml)=A _測定/A _標準×0.5
液體樣品輔酶Q10含量：CoQ10(mg)=A _測定/A _標準×0.5×V _T
每100g固體樣品輔酶Q10含量：CoQ10(mg/g)=A _測定/A _標準×0.5×V _T×100/m
式中：A _測定=測定管的吸光度
A _標準=標準管的吸光度
0.5=CoQ ₁₀標準的濃度(mg/ml)
V _T=CoQ ₁₀提取液的總體積(ml)
m=樣品的實際用量(g)
 
注意事項：
1、待測樣品中不能含有CoQ ₁₀抑制劑，同時需避免反復凍融。
2、在皂化過程中，震蕩不要劇烈，以免形成乳化層。
3、CoQ ₁₀ Assay buffer 如果出現渾濁或絮狀物，應棄用。
4、CoQ ₁₀標準梯度應準確，盡量減少不必要的誤差。
5、EC solution有一定毒性，請小心操作。
6、檢測標準品時，按步驟3表格混合后，2min內即出現明顯的藍色變化并逐漸加深，20min后藍色開始變淺，30min 后逐漸呈黃綠色。620nm檢測數據表明，隨著時間的延長，OD值在不斷的下降，對應的顏色也已發生變化，特別是高濃度的標準品變化比較大。因此，應在出現最深的藍色結果且穩定的時間段內盡快檢測，而且建議每次同時檢測標準品(0.3~0.5mg/ml)和樣品。如有條件，最好用酶標儀檢測，減少因檢測時間導致的誤差。
7、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。 
 
有效期：6 個月有效。
 
附一：參考標準曲線范圍：
雅吉生物測定CoQ ₁₀標準0.04、0.1、0.3、0.5、1、2、5mg/ml在630nm 時吸光度，據此做出其標準曲線。

附二： CoQ 10 的提取方法 （來源于網絡，僅供參考）
方法一、醇堿皂化法
皂化液的制備 取豬心殘渣，壓干稱重，按干渣重加 300g/L 工業焦性沒食子酸，攪勻，加醇-堿溶液(干渣重 3~3.5 倍量乙醇、320g/L 氫氧化鈉)，加熱攪拌回流 25~30min，迅速冷卻至室溫，得皂化液。
 濃縮液的制備 取皂化液，立即加入其體積 1/10 量的石油醚或 120 號汽油提取 3~4 次，攪拌，分層，得提取液。水洗至近中性，在 40℃以下濃縮至原體積的 1/10，冷卻，-5℃以下靜置過夜，過濾，得濃縮液。
 輔酶Q ₁₀精制品的制備 將濃縮液過硅膠柱層析，先后用石油醚、10%乙醚-石油醚洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，得黃色油狀物。加熱無水乙醇溶解，過濾，濾液靜置，冷卻結晶，真空干燥，得輔酶Q ₁₀ 精制品。
方法二、醇醚混合溶劑提取法
輔酶Q ₁₀粗制品的制備 取豬心殘渣，加1.5倍量的V _乙醇：V _乙醚=3：1 混合溶劑，加熱提取3~4 次，每次15~20min，冷至室溫，過濾，合并提取液。濃縮，加適量水，加石油醚提取， 提取液濃縮，濃縮物為黃色油狀物，即輔酶Q ₁₀粗制品。
輔酶Q ₁₀成品的制備 取輔酶Q ₁₀粗制品，加丙酮溶解，置-10℃以下析出雜質，過濾，濾液蒸去丙酮，加少量石油醚溶解，過硅膠柱層析分離，加無水乙醇結晶，得輔酶 Q ₁₀ 成品。