一個成熟、穩定的PCR反應成形之前必會經歷許多的坎坷，優質模板的獲取、高特異性引物的設計、反應體系各組分的優化、反應程序的優化等等。今天我們來聊聊反應程序優化的那些事兒。

首先，優質的模板是PCR成敗的前提，沒有優質的模板后續工作做得再好也是巧婦難為無米之炊。優質的模板除了濃度和純度外，模板的完整性也是一個關鍵因素。不能僅以純度（260/280、260/230的比值）來衡量模板的優劣，一定要跑個膠確認下。

例如石蠟切片核酸的提取，即使比值堪稱完美，沒有膠圖參考的情況下也不建議直接進行后續的擴增實驗，因為極易翻車。解交聯后核酸會片段化，一不注意都碎成了幾十bp的長度……那之前檢測的濃度和純度就成了擺設，一點意義也無。

再說引物的特異性，這方面常見的是去NCBI檢索現成的引物或者依靠引物設計軟件自行設計。將設計好的引物序列去基因庫比對一下，沒有重合就可以找合成公司去合成了（常用Primer 5設計引物，Oligo 7對引物進行評價。評分高的引物特異性高、引物二聚體的概率也低）。

反應體系優化這里簡單介紹一下鎂離子濃度的優化。dNTP可以結合鎂離子，被結合的鎂離子無法維持Taq酶的活性，所以鎂離子的摩爾濃度一定要比dNTP的總濃度要高。但是過高的鎂離子濃度又會增加Taq酶的錯配率，所以鎂離子的濃度是關乎擴增效果的一個重要參數。

反應程序則多集中于優化退火溫度。退火溫度常設置在引物對的Tm值附近，若想得到較高的保真率，退火溫度就略高于Tm值；若想得到較高的產物，退火溫度就略低于Tm值。教材中常用的55℃退火72℃延伸，便是因為55℃處于大多引物的Tm值附近（或略低），這一設定也許不是最適的退火溫度但一般能擴增出產物（72℃是Taq酶最適溫度）。

最后聊一下反應程序優化中經常被忽略的一個環節-變溫速率。變溫速率，尤其是變性-退火這一環節的變溫速率尤其重要。相對緩慢的變溫速率，有助于堿基嚴格按照堿基互補配對原則進行反應，這一點不論是從HRM實驗中非沃森-克里克結構的形成及消除還是DNA oligo的退火實驗都有體現，甚至可以說是極端體現。當我們實驗時遇到了熔解曲線主峰前有雜峰、測序結果套峰等不良結果時不妨把退火的降溫速率下調一些，緩一緩，或許能看到另一番風景。

最后的最后分享兩張圖：模板，反應程序、反應體系一致，只調試了退火降溫速率。

圖1：變溫速率2℃/sec

圖2：變溫速率4℃/sec