在生物醫(yī)學成像領(lǐng)域，雙光子激發(fā)（TPE）熒光成像技術(shù)正嶄露頭角，為科學家們提供了一種強大的工具，尤其在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGCs）的研究中，展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。視網(wǎng)膜作為唯一可以通過光學非侵入性成像單個神經(jīng)元的組織，其神經(jīng)節(jié)細胞的動態(tài)變化對于眼科學研究具有關(guān)鍵意義。然而，傳統(tǒng)的成像技術(shù)在研究視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞功能和結(jié)構(gòu)時存在諸多限制，例如穿透深度不足、光毒性較大以及無法實現(xiàn)三維高分辨率成像等。雙光子掃描激光檢眼鏡的出現(xiàn)，為解決這些難題提供了新的思路和方法。將深入探討雙光子掃描激光檢眼鏡技術(shù)的原理、優(yōu)勢以及在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞成像中的應(yīng)用前景。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的功能與特性
視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGCs）是視覺信息傳遞的關(guān)鍵神經(jīng)元，其軸突組成視神經(jīng)，將光信號轉(zhuǎn)換為神經(jīng)信號傳遞到大腦。這些細胞在視覺信息處理中起著至關(guān)重要的作用，包括視覺敏銳度和對比敏感度的形成。RGCs存在多種亞型，具有不同的功能特性，但目前對于活體內(nèi)單個RGCs的功能分析仍較為缺乏，這限制了我們對視網(wǎng)膜疾病的深入理解。

視網(wǎng)膜成像技術(shù)的局限性
傳統(tǒng)的視網(wǎng)膜成像技術(shù)如共聚焦掃描激光檢眼鏡（CSLO），雖然實現(xiàn)了對視網(wǎng)膜細胞的非侵入性觀察，但在功能成像方面存在挑戰(zhàn)。例如，CSLO主要依賴于熒光報告分子的結(jié)構(gòu)成像，難以直接反映細胞的功能狀態(tài)。此外，由于哺乳動物視網(wǎng)膜中視錐細胞和熒光報告分子的光譜敏感性存在重疊，導(dǎo)致在功能成像時容易產(chǎn)生干擾，影響對視網(wǎng)膜功能的準確評估。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
雙光子激發(fā)的理論基礎(chǔ)
雙光子激發(fā)熒光成像的核心原理在于雙光子吸收（TPA）過程。在TPA中，兩個低能量光子同時被吸收，其總能量等于分子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)所需的能量。這種非線性吸收過程的概率與入射光的強度平方成正比，因此需要高功率的脈沖激光源來實現(xiàn)有效的激發(fā)。通過使用飛秒脈沖激光，TPE技術(shù)能夠在保證高激發(fā)效率的同時，將光脈沖持續(xù)時間控制在極短范圍內(nèi)，從而提高雙光子信號的生成效率。

成像實驗與結(jié)果分析
實驗設(shè)置與動物模型
實驗使用了Thy1-YFP-16和Thy1-GCaMP3兩種轉(zhuǎn)基因小鼠模型。這些小鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞分別表達黃色熒光蛋白（YFP）和鈣離子指示劑GCaMP3，便于通過雙光子掃描激光檢眼鏡進行成像觀察。在實驗過程中，小鼠被麻醉并進行處理，以確保成像過程的穩(wěn)定性和圖像質(zhì)量。成像系統(tǒng)通過空芯光纖將激光傳輸至小鼠視網(wǎng)膜，并收集反射和熒光信號，實現(xiàn)了對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的高分辨率成像。

總結(jié)與展望
雙光子掃描激光檢眼鏡技術(shù)作為一種新興的視網(wǎng)膜成像工具，憑借其高組織穿透力、低光毒性和固有的三維切片能力，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的結(jié)構(gòu)和功能成像方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。通過激發(fā)外源性和內(nèi)源性熒光物質(zhì)，該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對視網(wǎng)膜細胞的高分辨率成像，并提供細胞健康狀態(tài)和功能活動的重要信息。在實驗研究中，雙光子掃描激光檢眼鏡成功地對活體小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞進行了動態(tài)觀察，不僅實現(xiàn)了細胞結(jié)構(gòu)的可視化，還初步探索了細胞功能成像的可行性，為視網(wǎng)膜疾病的機制研究和治療效果評估提供了有力的技術(shù)支持。

未來，隨著技術(shù)的不斷進步和優(yōu)化，雙光子掃描激光檢眼鏡有望在臨床診斷和治療監(jiān)測中發(fā)揮更重要的作用。然而，目前該技術(shù)在臨床轉(zhuǎn)化方面仍面臨一些挑戰(zhàn)，如設(shè)備的便攜性、操作的簡便性以及成像速度的提升等。此外，如何進一步提高成像的分辨率和靈敏度，以及如何開發(fā)更多適用于臨床的熒光探針和成像模式，也是未來研究的重要方向。盡管如此，雙光子掃描激光檢眼鏡技術(shù)的出現(xiàn)無疑為眼科學領(lǐng)域帶來了一場成像技術(shù)的革新，為揭開視網(wǎng)膜疾病的神秘面紗提供了新的希望和可能。我們期待在不久的將來，這項技術(shù)能夠在臨床應(yīng)用中大放異彩，為人類的視覺健康保駕護航。

DOI：10.1007/978-3-030-16638-0_9.