Author：Katharina Meditz and Beate Rinner

1 原代腫瘤細胞培養(yǎng)的重要性：盡可能接近體內(nèi)
喬治和瑪格麗特·蓋花了近30年的時間試圖建立一個不朽的人類細胞系，以了解腫瘤的生物學(xué)和機理。在建立了組織培養(yǎng)實驗室后，喬治·蓋伊取得了巨大的突破——他從宮頸癌中分離出了第一個腫瘤細胞系，他將其命名為HeLa。喬治·蓋伊（GeorgeGey）總是說：“癌癥的關(guān)鍵就在我們的指尖上——只要我們能伸手抓住它”。不幸的是，他死于胰腺腫瘤。

自從發(fā)現(xiàn)細胞系以來，它們的重要性一直在持續(xù)，甚至在增加。原因如下：（i）它們易于處理，（ii）它們提供無限的自我復(fù)制，（iii）它們具有相對較高的同質(zhì)性，（iv）它們很容易從冷凍庫存中替換。因為（i）細胞系在傳代過程中容易發(fā)生基因型和表型漂移，（ii）細胞系在多年內(nèi)儲存不好，（iii）細胞系亞群引起表型變化，以及（iv），所以沒有陽性而沒有陰性來自不同實驗室的細胞系顯示不同的核型，因此可能缺乏重復(fù)性。

1.1 細胞培養(yǎng)定義
原代培養(yǎng)是直接取自組織的初始培養(yǎng)；它最接近原始組織，是研究的基礎(chǔ)。細胞可以直接從組織中遷移和生長（外植體技術(shù)），或者細胞可以通過酶或機械方法從腫瘤組織中分離出來。就其生長行為而言，細胞可以作為貼壁培養(yǎng)物在體外生長，也可以懸浮生長。

腫瘤細胞生長并覆蓋整個細胞培養(yǎng)瓶后，必須將細胞轉(zhuǎn)移到新的細胞培養(yǎng)瓶中，原代腫瘤細胞的命名發(fā)生變化，成為細胞系。有兩類細胞系，一類是種群無限膨脹的連續(xù)細胞系，另一類是具有一定壽命的有限細胞系。目前，在細胞庫中有大量不同的細胞系，這些細胞系具有很好的特征。然而，建立新的細胞系仍然是有用的，因為異質(zhì)性腫瘤需要不同的細胞系系統(tǒng)來研究腫瘤的生物學(xué)特性。培養(yǎng)時間很長的細胞系可以改變其遺傳和表型特征。

2 從組織到所需細胞的長距離
從組織到所需的細胞可能需要很多時間，也可能非常棘手；取決于細胞的生長行為和現(xiàn)有組織中腫瘤細胞的數(shù)量。本章概述了腫瘤組織、培養(yǎng)基和細胞分離。通過使用腫瘤生長方面的對比實例，將解釋從非常侵襲性的NRAS黑色素瘤腫瘤中建立名為MUG-Mel2的細胞系以及建立非常緩慢生長的脊索瘤腫瘤，名為MUG-Chor1和MUG-CC1。

2.1 腫瘤組織
拉丁語單詞tumor的翻譯是“腫脹”。著名病理學(xué)家Wallace H.Clark對單詞tumor給出了極好的定義：“腫瘤是一組異常細胞，其特征是在時間上不受限制地生長，并且能夠在至少三個不同的組織隔室中生長——原始隔室、原發(fā)部位的間質(zhì)（腫瘤侵襲）和遠處的間質(zhì)（腫瘤轉(zhuǎn)移）”。實體瘤的結(jié)構(gòu)為實質(zhì)（腫瘤細胞）和間質(zhì)細胞（周圍的腫瘤細胞）。來源于上皮的腫瘤可以顯示出這些間隔與基底層的分離。這意味著腫瘤不僅存在于惡性細胞，還存在許多其他細胞。腫瘤微環(huán)境（TME）也是必不可少的.根據(jù)腫瘤實體的不同，TME可能由免疫系統(tǒng)細胞、血管和淋巴管細胞、成纖維細胞、周細胞和脂肪細胞組成，數(shù)量差異很大[2].一些細胞很容易通過典型的形態(tài)進行區(qū)分，如上皮部分，主要是具有典型鵝卵石形態(tài)的單個細胞，基質(zhì)部分由成纖維細胞組成，細胞具有典型的成纖維細胞雙極紡錘形；免疫細胞在粘附細胞或肥大細胞/macr上方呈現(xiàn)球狀細胞棺材。

手術(shù)后應(yīng)立即獲取腫瘤組織，移除周圍的腫瘤組織，為避免污染，應(yīng)在PBS+10%PS中進行10分鐘的抗生素浴。抗生素浴后，將腫瘤組織轉(zhuǎn)移到PBS或培養(yǎng)基中，然后用剪刀或手術(shù)刀b將組織切成非常小的碎片（1–2 mm³）。將腫瘤組織分解成小塊c后，收集懸浮液，并將PBS或培養(yǎng)基中的腫瘤塊離心。如果方案中有規(guī)定，則將切碎的腫瘤組織d旋轉(zhuǎn)，并在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中設(shè)置不同的部分。

2.2 成功的四個步驟
在第一步中，腫瘤組織的狀況非常重要。缺血時間短是一個優(yōu)勢，但只要組織在培養(yǎng)基中保持低溫（4°C），你可以在手術(shù)后24小時從組織中分離細胞。從手術(shù)到實驗室的組織運輸應(yīng)在不含任何添加劑的介質(zhì)中進行，如血清（FBS）或抗生素，以防止其干燥。無FBS對于在運輸過程中抑制細胞生長很重要。無抗生素，因為在實驗室中，每個組織將在10次抗生素浴中培養(yǎng)10分鐘，以避免污染，如果運輸介質(zhì)中含有抗生素，則無法確定抗生素濃度和培養(yǎng)時間。活細胞只能從新鮮的活腫瘤組織中分離出來。

創(chuàng)建細胞系的第二步是知道要分離哪種細胞，然后跟蹤它們！良好的本能是成功建立細胞系的必要條件。

在第三步中，每個腫瘤都需要自己的分離方法，而這種方法和培養(yǎng)基在大多數(shù)文獻中都可以找到。一種非常普遍的方法是機械分離或用剪刀或鋒利的刀片將組織切割成非常小的碎片——通常為1-2 mm³，可以選擇通過尼龍過濾器（50-100 μm開口）過濾均質(zhì)，旋轉(zhuǎn)并重復(fù)這些步驟以去除死細胞、碎片，以及各種不同的細胞類型。

我們必須意識到，在分離腫瘤細胞的過程中，可能會有不同數(shù)量的非腫瘤細胞，這將使腫瘤細胞系的建立復(fù)雜化。因此，由病理學(xué)家檢查腫瘤的組織切片以確定存在的腫瘤細胞的比例非常重要，因為這將影響細胞系生長的成功。酶解也是分離單個細胞的一種方法：有不同的酶適合將細胞從實體瘤中分離出來，并將切碎的組織消化成單個細胞。酶的濃度、溫度和培養(yǎng)時間對保持細胞活力和完整性非常重要。有多種酶可用，包括膠原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和彈性蛋白酶。每種具有不同靶點的酶對不同的腫瘤具有親和力。

第四步，每個細胞需要自己的培養(yǎng)基；因此，在建立任何細胞系之前，對所有文獻進行徹底研究是一個先決條件。有多種可用的基本培養(yǎng)基，可以通過不同的添加劑來適應(yīng)細胞的需要。然而，在生產(chǎn)特定介質(zhì)時，必須注意保持滲透壓。例如，F(xiàn)BS的增加（從10%增加到30%）會強烈影響介質(zhì)的滲透壓。相比之下，人體血液的滲透值為300 mOsmolkg^-1，大多數(shù)基本培養(yǎng)基的滲透值為280–340 mOsmolkg^?1。 通過培養(yǎng)基中的添加劑，例如ITS，重組人胰島素、人轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉的混合物，有不同的方法促進細胞的粘附或生長。細胞的粘附也可以通過在細胞培養(yǎng)瓶中涂上各種酶（如纖維連接蛋白或基質(zhì)凝膠）來加強。

2.3 方案：建立貼壁生長腫瘤的腫瘤細胞系

• 腫瘤組織的制備：用無菌剪刀或手術(shù)刀去除非腫瘤組織（脂肪組織、血凝塊和結(jié)締組織）。
• 為降低污染風(fēng)險，建議使用10×PS溶液的抗生素浴，培養(yǎng)約10分鐘。
• 將腫瘤組織從抗生素浴轉(zhuǎn)移到PBS或培養(yǎng)基中。
• 用無菌鑷子、剪刀或手術(shù)刀將腫瘤機械和/或酶分解成非常小的碎片，以獲得更多的表面以供腫瘤細胞生長。
• 可選：腫瘤塊的渦流。
• 離心并除去上清液。
• 用合適的培養(yǎng)基在不同的細胞培養(yǎng)瓶中重新培養(yǎng)（由于培養(yǎng)瓶的過濾作用，細胞可能比在6孔培養(yǎng)皿中生長得更好）
• 在37°C的加濕培養(yǎng)箱中，在CO₂氣氛中培養(yǎng)細胞（CO₂量取決于所用培養(yǎng)基）。
• 定期對腫瘤細胞進行形態(tài)學(xué)觀察。
• 當(dāng)整個細胞培養(yǎng)瓶過度生長并消耗培養(yǎng)基時，需要進行傳代培養(yǎng)（分裂）。
• 亞培養(yǎng)：使用蛋白水解酶（如胰蛋白酶）或更溫和的Accutase使粘附單層脫離。電池接觸中斷，電池處于懸浮狀態(tài)；離心后，可將細胞接種到具有適當(dāng)細胞量的新燒瓶和新的新鮮培養(yǎng)基中，以繼續(xù)細胞生長。

2.4 特性描述
腫瘤組織中存在大量不同的細胞，因此盡快對生長出的細胞進行定性是非常重要的。癌細胞的一個特征是復(fù)制不朽，這意味著癌細胞的分裂能力是正常細胞的數(shù)倍。通常只有成纖維細胞在腫瘤細胞上發(fā)育和生長。成纖維細胞也有能力在培養(yǎng)物中保持很長時間，在培養(yǎng)物中最多可傳代50代。成纖維細胞的問題在于，它們的形態(tài)并不總是可識別的，而且成纖維細胞常常被錯誤地與腫瘤細胞混淆。由于這些原因，必須盡快檢測腫瘤潛能。在大多數(shù)情況下，一開始只有很少的腫瘤細胞可用，并且表征方法必須與細胞數(shù)量相適應(yīng)。在第一個生長階段，只能進行形態(tài)學(xué)觀察。所建立的細胞系應(yīng)具有與起源組織相同的特征，然而，例如，可以用波形蛋白檢測間充質(zhì)起源，用細胞角蛋白檢測上皮特征。為了檢測細胞的腫瘤潛能，可以進行集落形成單位分析；該分析只需要少量細胞，并通過克隆生長顯示細胞的腫瘤潛能。腫瘤細胞表現(xiàn)為非整倍體和染色體不穩(wěn)定性，流式細胞術(shù)的細胞周期分析可以揭示細胞的倍體狀態(tài)，而核型分析則揭示腫瘤細胞的染色體不穩(wěn)定性。腫瘤標(biāo)志物和遺傳圖譜在培養(yǎng)過程中應(yīng)保持恒定表達；然而，一些標(biāo)記可能在栽培過程中丟失。為了確認已建立的細胞系是從起源組織中發(fā)展而來，強烈建議通過STR分析進行DNA分析，以證明腫瘤的身份。

3 關(guān)于建立腫瘤細胞系的一般提示
一般來說，為了產(chǎn)生腫瘤細胞系，細胞應(yīng)該（i）定期冷凍保存，（ii）傳代100次以上并在培養(yǎng)物中保留12個月以上，（iii）在培養(yǎng)過程中主要保持其遺傳表型和形態(tài)。

3.1 Hayflick問題
種植過程中的一個問題是所謂的Hayflick限制。倫納德·海弗利克（Leonard Hayflick）和保羅·穆爾海德（Paul Moorhead）發(fā)現(xiàn)，來自胚胎組織的人類細胞在培養(yǎng)基中只能分裂有限次。細胞培養(yǎng)分為三個階段。來自外植體或組織的細胞生長被稱為第一階段。細胞分裂代表第二階段。然后細胞在培養(yǎng)基中增殖，這取決于細胞類型，在一段時間后，細胞開始分裂更慢，也可以停止分裂，這被定義為第三階段。Hayflick和Moorhead將生長停滯現(xiàn)象描述為Hayflick極限或復(fù)制性衰老。如果細胞減少或停止分裂，應(yīng)將其轉(zhuǎn)移到具有更高細胞密度的新燒瓶中，F(xiàn)BS濃度可短時間增加，強烈建議僅改變50%的培養(yǎng)基，以保持自體生長因子的培養(yǎng)。培養(yǎng)快速生長的細胞比培養(yǎng)緩慢生長的細胞容易得多；然而，細胞可以毫無理由地停止分裂。

3.2 去除其他細胞

腫瘤組織中存在許多不同的細胞。為了去除非致瘤細胞，可以使用選擇性粘附和分離技術(shù)。成纖維細胞和腫瘤細胞呈現(xiàn)不同的密度和大小；胰蛋白酶化后，細胞可以轉(zhuǎn)移到新的細胞培養(yǎng)瓶中。經(jīng)過一段時間（例如，10分鐘–2小時），某些細胞將沉降到底部，剩余的培養(yǎng)基應(yīng)移到新的燒瓶中，并可重復(fù)上述過程。從腫瘤中分離出的細胞的不同部分也非常有用，如本例中所示，用于建立MUG-Chor1。保持所有的部分都在培養(yǎng)中，希望其中一部分腫瘤細胞開始生長！上述成纖維細胞分離以及提取的部分意味著在細胞系建立期間培養(yǎng)箱中一次可容納30多個燒瓶。因此，需要記錄每個燒瓶的完整描述。原始文化最重要的一點是，在修煉過程中不要丟棄任何東西，要有耐心！在下一篇文章中，將討論三種腫瘤細胞系的建立。

4 腫瘤細胞系的建立：三例
4.1 脊索瘤細胞系的建立
脊索瘤是一種罕見的惡性腫瘤，起源于脊索的胚胎殘余，僅發(fā)生于斜坡至骶骨的中線。手術(shù)加放療是標(biāo)準治療方法。由于脊索瘤對標(biāo)準化療具有耐藥性，因此迫切需要建立更多的脊索瘤細胞系來尋找替代治療方案。脊索瘤和由此產(chǎn)生的細胞系的特征是根據(jù)其形態(tài)，由各種溶酶體、液泡和典型的含藻體表達。免疫組化顯示brachyury和細胞角蛋白8陽性，并顯示緩慢的生長動力學(xué)。建立脊索瘤細胞系非常困難，因為腫瘤細胞生長非常緩慢，并且被其他快速生長的細胞包圍，例如基質(zhì)細胞和免疫細胞。為了去除成纖維細胞，可以使用選擇性粘附和分離技術(shù)。

4.1.1 骶骨脊索瘤細胞系MUG-Chor1的建立
為了建立脊索瘤細胞系，手術(shù)后立即獲取腫瘤組織。在將腫瘤組織機械分解成約1–2 mm³塊后，將培養(yǎng)物的混合物分為幾部分進行。組分I含有機械分離的腫瘤細胞。在37℃下用200 μL膠原酶對腫瘤片進行酶處理30分鐘后，組分II包含一個細胞組分，組分III僅包含腫瘤片，用蓋玻片壓下，以促進細胞生長到細胞培養(yǎng)瓶中。所有組分均在含有10%胎牛血清、1%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸鈉（ITS）、2 mM谷氨酰胺和1%青霉素/鏈霉素的Iscove/RPMI 4:1中培養(yǎng)。在37℃下，在5% CO₂的增濕大氣中進行培養(yǎng)。脊索瘤細胞在pH值為7.4時生長。經(jīng)過4個月的培養(yǎng)期和5次傳代后，細胞出現(xiàn)危機。FBS濃度從10%增加到20%，ITS濃度從1%增加到5%。在應(yīng)用這些條件1周后，再次使用初始培養(yǎng)基。危機過后，細胞持續(xù)生長，并顯示出大約7-10天的倍增時間。每周更換兩次培養(yǎng)基，每10天在70–80%的匯合點進行細胞培養(yǎng)的分裂。通過PCR定期檢查所有細胞培養(yǎng)物中的支原體。

4.1.2 斜坡脊索瘤細胞系MUG-CC1的建立
建立腫瘤細胞系的另一個問題是在腫瘤手術(shù)期間維持細胞的活力。各種手術(shù)技術(shù)，例如，電切鏡，可以對細胞的活力產(chǎn)生影響；此外，斜坡脊索瘤細胞由于生長緩慢和腫瘤的位置，很難建立。因此，選擇了一種特別小心的手術(shù)方法。格拉茨醫(yī)科大學(xué)的跨學(xué)科顱底單元為四手經(jīng)鼻蝶竇內(nèi)窺鏡手術(shù)的發(fā)展做出了重大貢獻。重點在于仔細的組織保存和獲取足夠的細胞材料，作為最佳細胞培養(yǎng)的先決條件。在適當(dāng)進入斜坡區(qū)并暴露腫瘤后，進行初步腫瘤去瘤。這種手術(shù)方法的特殊優(yōu)勢在于直接顯示病變，并有機會從活體腫瘤塊中獲得無污染（血液、粘液、粘膜等）和結(jié)構(gòu)完整的腫瘤組織。用于建立細胞系的原代細胞取自一名72歲男性患者，該患者因右側(cè)外展神經(jīng)麻痹而被轉(zhuǎn)診到神經(jīng)外科，導(dǎo)致雙眼失明、眩暈和頭暈。機械分離后，細胞處于生命狀態(tài)，但生長緩慢。

如果感興趣的細胞表現(xiàn)出非常緩慢的生長行為，則存在其他細胞消耗培養(yǎng)基并取代腫瘤細胞的風(fēng)險。從培養(yǎng)開始就立即分離細胞也很棘手，因為它們需要周圍細胞中的生長因子和細胞因子。在建立細胞系MUG-CC1的過程中，B細胞過度生長，腫瘤細胞開始死亡，原因可能是快速生長的B細胞的培養(yǎng)基消耗或兩種細胞系的不協(xié)調(diào)。

懸浮細胞容易與貼壁細胞分離。然而，正確的分離時間點很重要；否則，腫瘤培養(yǎng)就會丟失。在那個時間點，當(dāng)懸浮細胞和貼壁細胞一起培養(yǎng)時，可能會發(fā)生致命的錯誤；在某些情況下，人們錯誤地認為自發(fā)永生的懸浮細胞可能是腫瘤細胞。因此，懸浮細胞的表征非常重要。

在通過形態(tài)學(xué)建立MUG-CC1的過程中，淋巴母細胞樣細胞系（LCL）的特征是，淋巴母細胞樣細胞與單個細胞一起以典型的花環(huán)形態(tài)在懸浮群中生長。流式細胞術(shù)分析顯示B細胞標(biāo)記物（CD19）呈陽性，而T細胞（CD3）和自然殺傷細胞（CD56）的標(biāo)記物缺失。細胞的DNA含量也可用于表征，而腫瘤細胞主要表現(xiàn)為非整倍體DNA含量，淋巴母細胞表現(xiàn)為二倍體DNA圖譜。拷貝數(shù)譜顯示了一個平衡的譜，表明是一個非致瘤細胞系。在MUG-CC1-LCL中檢測到EBV（TC 70和TC 72）的EB2（BMLf1）基因強陽性，表明EBV轉(zhuǎn)染，并解釋了永生狀態(tài)。

4.2 侵襲性生長黑色素瘤細胞系MUG-Mel2的建立
細胞系MUG-Mel2是從一名48歲男性皮膚原發(fā)性潰瘍性黑色素瘤（8.5 mm厚）患者的皮膚轉(zhuǎn)移的新鮮標(biāo)本中獲得的。原發(fā)腫瘤和皮膚轉(zhuǎn)移的遺傳分析顯示NRASQ61R基因突變；未檢測到BRAF或c-kit突變。腫瘤和已建立的細胞系表達黑色素瘤標(biāo)記物，如Melan-A、HMB-45、S100和酪氨酸酶。手術(shù)后立即獲得腫瘤組織（皮膚轉(zhuǎn)移）；在將腫瘤組織機械分解成約1–2 mm³塊后，將細胞培養(yǎng)在含有10% FBS、2 mmL-谷氨酰胺和1%青霉素/鏈霉素的RPMI（加州卡爾斯巴德生命技術(shù)公司）中。黑色素瘤細胞在pH值為7.4時生長。細胞生長至80%匯合，并用Accutase從燒瓶中分離。特別是在培養(yǎng)開始期間，細胞應(yīng)保持在非常高的密度，以促進細胞間的接觸和細胞生長。所有細胞的培養(yǎng)均在37°C、5% CO₂的增濕空氣中進行。定期檢查所有細胞

通過PCR檢測支原體。圖4.6顯示了從培養(yǎng)開始，在黑色素瘤和周圍成纖維細胞樣細胞中常見的具有三角形樹突形態(tài)的突出細胞。由于黑色素瘤細胞的快速生長，其他細胞如成纖維細胞被取代。10天后，進一步培養(yǎng)純黑色素瘤細胞，并且上述所有黑色素瘤標(biāo)記物能夠保持在培養(yǎng)基中。

5 質(zhì)量檢查

5.1 記錄和凍結(jié)
細胞系建立過程中最重要的任務(wù)是保存細胞培養(yǎng)工作的完整文檔。每個實驗室都應(yīng)創(chuàng)建合適的標(biāo)簽?zāi)Ｊ健τ诿總€細胞系，應(yīng)使用單獨的等分培養(yǎng)基燒瓶。此外，還必須遵守有效期。必須在培養(yǎng)開始期間進行形態(tài)學(xué)觀察和拍照，并定期進行冷凍保存，以獲得不同傳代的冷凍材料。對于低溫保存，建議使用90% FBS和10% DMSO的混合物。不要冷凍到更少的細胞；如果你有少量的細胞，使用體積較小的冷凍瓶。

5.2 污染
細胞培養(yǎng)中存在多種污染，分為兩個主要領(lǐng)域：微生物和細胞間污染。你在一種文化中工作的越多，污染的風(fēng)險就越大。一次只能處理一個細胞系，尤其是處理原代細胞時。需要無菌技術(shù)來防止微生物污染。

5.2.1 微生物污染
細胞培養(yǎng)中的主要污染物是細菌、支原體、真菌、酵母和病毒。污染源可能是不良的無菌技術(shù)、介質(zhì)添加劑或腫瘤組織（例如支原體）。必須對污染進行監(jiān)測和測試。易于檢測的有細菌（濁度增加或混濁、細顆粒、移動）、酵母（短鏈的小橢圓形生物體）和真菌（細絲狀菌絲體），而支原體和病毒更難檢測。支原體是小型原核生物，顯微鏡下無法觀察到它們的存在。支原體污染的后果可能包括生長速率效應(yīng)，染色體改變核酸和氨基酸合成，以及膜改變。許多不同的支原體檢測方法在成本、時間、可靠性、特異性和敏感性方面都有優(yōu)勢和劣勢。PCR和ELISA技術(shù)為檢測支原體提供了一種非常敏感、特異和快速的選擇，同時覆蓋了廣泛的支原體檢測范圍。最難檢測的污染是病毒污染，但除非是細胞病變，否則它們可能對宿主細胞幾乎沒有影響。

5.2.2 細胞污染
“假”細胞系——30多年前，通過證明細胞系被HeLa細胞污染，強調(diào)了培養(yǎng)中細胞的交叉污染。特別是在使用原電池時，很容易發(fā)生電池間污染。細胞錯誤識別的原因可能是人為錯誤（錯誤標(biāo)記、未消毒的工作條件、交叉污染）或所用技術(shù)的不良結(jié)果（使用飼養(yǎng)層或異種移植）。你在一種文化中工作的越多，污染的風(fēng)險就越大。一次只能處理一個細胞系，并確保每個細胞系都有自己的培養(yǎng)基、胰蛋白酶和PBS。特別是貼壁細胞由于其形態(tài)可以保持分離，但原代細胞的形態(tài)尚不清楚。為了確保使用正確的細胞，應(yīng)該進行DNA分析。STR DNA分析技術(shù)用于人類細胞系、干細胞和組織的常規(guī)鑒定（鑒定）。STR分析是指短串聯(lián)重復(fù)序列DNA，用于檢測DNA中的各個區(qū)域。某些DNA區(qū)域的差異可以用來區(qū)分個體。然而，人類STR分析僅限于物種鑒定。這意味著無法識別來自其他物種（如小鼠或大鼠）的細胞系的污染。在基于人類的STR分析中，未檢測到非人類DNA的存在。動物物種可以通過同工酶分析來檢測。即使在建立細胞系的過程中，交叉污染的風(fēng)險也非常高！因此，切勿同時處理原代細胞培養(yǎng)和連續(xù)細胞系。