Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis

Subject terms: Cell biology, Systems biology

動(dòng)脈粥樣硬化是一種主要影響動(dòng)脈的多因素慢性炎癥性疾病。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。血管內(nèi)層的內(nèi)皮細(xì)胞與血液直接接觸，并因各種風(fēng)險(xiǎn)因素（如高膽固醇血癥、糖尿病、高血壓、吸煙和衰老）而變得功能失調(diào)和發(fā)炎，尤其是在與血流紊亂相關(guān)的特定動(dòng)脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)域。這些區(qū)域的擾動(dòng)流的特征是向內(nèi)皮細(xì)胞表面?zhèn)鬟f低幅度的振蕩剪切應(yīng)力（OSS）。內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)機(jī)械感應(yīng)受體（機(jī)械傳感器）檢測(cè)各種剪切應(yīng)力模式和幅度，并將這些機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞信號(hào)和隨后的結(jié)構(gòu)和功能反應(yīng)。

在這些內(nèi)皮炎癥部位，循環(huán)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合并遷移到內(nèi)皮下空間，分化成巨噬細(xì)胞。這些區(qū)域還顯示出對(duì)循環(huán)低密度脂蛋白（LDL）膽固醇的滲透性增加，LDL 膽固醇在內(nèi)皮下被氧化并被附近的巨噬細(xì)胞攝取，從而促進(jìn)泡沫細(xì)胞發(fā)育并引發(fā)炎癥和巨噬細(xì)胞積累的惡性循環(huán)。此外，這些區(qū)域的血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）轉(zhuǎn)化為合成表型并遷移到內(nèi)皮下層增殖，導(dǎo)致動(dòng)脈壁增厚。一些 VSMCs 轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，最終導(dǎo)致脂質(zhì)條紋和纖維脂肪斑塊的形成（圖1 a）。隨著動(dòng)脈粥樣硬化斑塊向外和向內(nèi)生長(zhǎng)、成熟和進(jìn)展，一些斑塊破裂，導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管事件，如心肌梗塞和中風(fēng)。

目前，控制致動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和炎癥的血流調(diào)控（血流敏感）的基因、蛋白質(zhì)和通路可能成為有希望的新治療靶點(diǎn)。為此，美國(guó)埃默里大學(xué)-佐治亞理工Wallace H. Coulter生物醫(yī)學(xué)工程系團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)綜述討論了當(dāng)前關(guān)于血流敏感基因、蛋白質(zhì)和通路的研究進(jìn)展，包括與內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的紊亂血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞重編程（FIRE）的新興概念。研究成果發(fā)表于 Nature Reviews Cardiology 期刊題為“Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis”。

圖1 動(dòng)脈粥樣硬化優(yōu)先發(fā)生在血流紊亂的部位。

內(nèi)皮細(xì)胞的剪切應(yīng)力

血管內(nèi)皮細(xì)胞不斷暴露在血流動(dòng)力學(xué)力下：血壓引起的動(dòng)脈壁正常（跨壁）應(yīng)力和周向應(yīng)力，以及血流引起的內(nèi)皮表面的切向剪切應(yīng)力（圖1 b）。雖然血管壁中的跨壁壓力和周向應(yīng)力主要影響和調(diào)節(jié)內(nèi)側(cè) VSMCs，但流體剪切應(yīng)力主要影響內(nèi)皮細(xì)胞，有效調(diào)節(jié)其功能。

由于復(fù)雜的血管幾何形狀和血流動(dòng)力學(xué)條件，血管系統(tǒng)不同區(qū)域的剪切應(yīng)力水平和方向模式差異很大（圖1 c）。在人體動(dòng)脈的直段、非分支區(qū)域，血流的粘性力超過(guò)慣性力，導(dǎo)致穩(wěn)定的單向?qū)恿鳎瑥亩騼?nèi)皮細(xì)胞提供高幅度的 ULS （~15 dyn/cm2）。相反，在彎曲和分支區(qū)域，慣性力變得更加突出，導(dǎo)致紊亂的多向振蕩流，將低幅度的 OSS（約 ±4 dyn/cm2）輸送到內(nèi)皮細(xì)胞表面（圖1 d）。

血流的臨床意義在于，動(dòng)脈粥樣硬化優(yōu)先發(fā)生在彎曲或分支的血管區(qū)域，這些區(qū)域暴露于流動(dòng)受干擾的環(huán)境，并存在其他危險(xiǎn)因素，如高膽固醇血癥和糖尿病。

血流誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型

臨床觀察強(qiáng)烈表明，血流紊亂與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生部位之間存在相關(guān)性，但其是否直接導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化一直是未知的，直到在動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí)。在部分頸動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)（PCL）模型中，左頸動(dòng)脈（LCA）誘導(dǎo)血流紊亂，具有典型的低幅度 OSS 模式（圖2 a）。在高脂飲食誘導(dǎo)高膽固醇血癥的Apoe?/? 小鼠或過(guò)表達(dá)PCSK9的C57BL/6小鼠中，PCL 手術(shù)在 2-3 周內(nèi)導(dǎo)致整個(gè) LCA 長(zhǎng)度的動(dòng)脈粥樣硬化快速發(fā)展。重要的是，在該小鼠模型中，對(duì)側(cè)右頸動(dòng)脈（RCA）繼續(xù)暴露于穩(wěn)定的血流中，且不會(huì)形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，是同一動(dòng)物的理想對(duì)照（圖2 b）。此外，收縮頸動(dòng)脈袖帶模型涉及在 RCA 的一部分上植入剪切應(yīng)力修改模型（圖2 b），它將 RCA 的該部分暴露于三種不同的剪切應(yīng)力狀態(tài)下：低幅度、穩(wěn)定的血流，這會(huì)誘導(dǎo)易損斑塊的發(fā)展；高幅度、穩(wěn)定的血流，無(wú)斑塊形成；以及紊亂血流，這會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定性斑塊的發(fā)展。該小鼠模型顯示了單頸動(dòng)脈內(nèi)血流依賴性動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展（圖2 b）。這兩種動(dòng)物模型已在全球眾多實(shí)驗(yàn)室中使用，是研究體內(nèi)血流依賴性內(nèi)皮細(xì)胞功能和動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的極其有價(jià)值的工具。

除了這些受干擾血流誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化的小鼠模型外，斑馬魚也被用作一種遺傳上易于處理的模型，用于檢查動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的早期事件。結(jié)合基因操作方法減少血流量，斑馬魚模型提供了進(jìn)一步的證據(jù)，證明在高膽固醇血癥條件下，血流紊亂會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。

此外，已經(jīng)開發(fā)了許多剪切應(yīng)力的體外模型，包括錐板粘度計(jì)、平行板流室和微流體通道。這些體外生物反應(yīng)器將內(nèi)皮細(xì)胞暴露在各種剪切條件下，可用于在明確的生物力學(xué)環(huán)境中確定剪切應(yīng)力依賴性內(nèi)皮功能的詳細(xì)機(jī)制（圖2 c、d）。

圖2 血流紊亂誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化模型。

血流調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能

體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞不斷暴露于各種血流動(dòng)力學(xué)因素，尤其是與血流相關(guān)的剪切應(yīng)力，它有效地調(diào)節(jié)了內(nèi)皮細(xì)胞功能的幾乎所有方面。明確穩(wěn)定血流保護(hù)內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)功能和紊亂血流誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙的機(jī)制對(duì)于了解血流依賴性動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療方法至關(guān)重要。

穩(wěn)定流通過(guò)控制緊密連接蛋白表達(dá)和與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的附著來(lái)促進(jìn)緊密連接穩(wěn)定性，以及通過(guò) VE-鈣粘蛋白的磷酸化和降解來(lái)控制粘附連接完整性，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞通透性。擾動(dòng)流通過(guò)多種機(jī)制增加內(nèi)皮細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡，包括下調(diào)腫瘤抑制蛋白 p53 的表達(dá)和抑制抗凋亡激酶AKT。穩(wěn)定流通過(guò) sirtuin 1 依賴性和 FOXO1 依賴性通路誘導(dǎo)自噬，為內(nèi)皮細(xì)胞提供細(xì)胞保護(hù)機(jī)制。擾動(dòng)流通過(guò) p53 依賴性和 sirtuin 1 依賴性機(jī)制誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞遷移并破壞動(dòng)脈修復(fù)機(jī)制。

血流還調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的新陳代謝和氧化還原反應(yīng)。雖然穩(wěn)定血流會(huì)降低內(nèi)皮葡萄糖攝取和代謝活性以及編碼糖酵解相關(guān)蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)，但紊亂血流會(huì)促進(jìn)糖酵解代謝，導(dǎo)致明顯不同的代謝組學(xué)特征和線粒體裂變?cè)黾印_動(dòng)流還增加了內(nèi)皮活性氧（ROS）的生成和氧化應(yīng)激。在動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓的情況下，內(nèi)皮響應(yīng)擾動(dòng)流的ROS 生成會(huì)增加血管氧化應(yīng)激和 LDL 氧化。

血流紊亂還有效誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，這在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。擾動(dòng)流通過(guò)增加內(nèi)皮粘附分子（VCAM1、ICAM1 和 E-選擇素）的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)皮炎癥，這些分子介導(dǎo)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。此外，擾動(dòng)流促進(jìn)了細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，如 IL-1、IL-6 和 CCL5。血流紊亂可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化（內(nèi)皮細(xì)胞到間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變；EndMT）和免疫樣細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞到免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)變；EndIT）。

機(jī)械傳感器和機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)

 內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)位于細(xì)胞頂端和基底表面、細(xì)胞間連接處和細(xì)胞內(nèi)的機(jī)械傳感器識(shí)別流體剪切應(yīng)力（圖3）。在頂端表面，機(jī)械傳感器包括質(zhì)膜蛋白，如陽(yáng)離子通道 PIEZO1 和 P2X 嘌呤受體4、NOTCH1、蛋白激酶、G 蛋白偶聯(lián)受體和叢狀蛋白D1，以及膜相關(guān)結(jié)構(gòu)，如小窩、糖萼和初級(jí)纖毛。

在細(xì)胞間連接處，血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（PECAM1）、VE-鈣粘蛋白和 VEGFR2 形成連接機(jī)械感覺(jué)復(fù)合物，該復(fù)合物通過(guò) PI3K-AKT 信號(hào)介導(dǎo)整合素激活、細(xì)胞排列和 eNOS 激活，以響應(yīng)穩(wěn)定血流。

在內(nèi)皮細(xì)胞的基底表面，血流誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合整合素機(jī)械傳感器的構(gòu)象激活和表達(dá)變化。穩(wěn)定的血流會(huì)激活整合素αvβ3，導(dǎo)致與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合增加，下游 RHO 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失活。此外，細(xì)胞質(zhì)中的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架已被證明用作機(jī)械感覺(jué)結(jié)構(gòu)。

圖3 內(nèi)皮細(xì)胞中的機(jī)械傳感器和機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

紊亂血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞重編程

該研究人員對(duì) PCL 手術(shù)后同一只小鼠的 LCAs（暴露于擾動(dòng)流 2 天或 2 周）和 RCAs（暴露于穩(wěn)定流 2 天或 2 周）獲得的單細(xì)胞進(jìn)行了研究，以血流依賴性和時(shí)間依賴性方式鑒定內(nèi)皮細(xì)胞和其他細(xì)胞類型的差異轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀基因組變化。scRNA-seq 和 scATAC-seq 結(jié)果獨(dú)立顯示，擾動(dòng)流以時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)小鼠頸動(dòng)脈細(xì)胞組成的動(dòng)態(tài)變化。

頸動(dòng)脈包含八個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞簇、四個(gè)單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞簇、一個(gè) VSMC 簇、一個(gè)成纖維細(xì)胞、一個(gè)樹突狀細(xì)胞和一個(gè) T 細(xì)胞，所有這些細(xì)胞在細(xì)胞身份和數(shù)量方面都以血流依賴性和時(shí)間依賴性方式變化。最有趣的是，頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在響應(yīng)血流時(shí)是異質(zhì)的和動(dòng)態(tài)的。在暴露于生理穩(wěn)定血流條件下的 RCA 中，鑒定出四個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞亞簇（E1-E4），并隨著時(shí)間的推移保持不變。然而，在暴露于促動(dòng)脈粥樣硬化擾動(dòng)流條件的 LCA 中，大多數(shù)健康的內(nèi)皮細(xì)胞亞簇（E2-E4）幾乎丟失，而新的內(nèi)皮細(xì)胞亞簇（E6 和 E8）出現(xiàn)。此外，在 RCA 內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)的 VSMCs 很少，但正如預(yù)期的那樣，紊亂的血流增加了 LCA 中的 VSMCs 數(shù)量。在 LCA 和 RCA 中均發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞，在 2 天擾動(dòng)流條件下，LCA 中發(fā)現(xiàn)的數(shù)量最高。盡管單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞簇在 RCA 中很少見，但 LCA 的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加，反映出血流紊亂時(shí)血管發(fā)生了實(shí)質(zhì)性的促炎和促動(dòng)脈粥樣硬化改變。與巨噬細(xì)胞一樣，RCA 中存在很少的樹突狀細(xì)胞和 T 細(xì)胞，但它們的數(shù)量因 LCA 中的擾動(dòng)流而增加。

為了了解擾動(dòng)流誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表型變化的潛在機(jī)制，分析了 8 個(gè)不同的內(nèi)皮細(xì)胞簇的差異基因表達(dá)和基因本體論。正如預(yù)期的那樣，典型健康內(nèi)皮細(xì)胞簇（E2）表達(dá)兩個(gè)最著名的機(jī)械敏感基因 Klf2 和 Klf4 的最高水平，并且這些基因在暴露于擾動(dòng)流的內(nèi)皮細(xì)胞簇中表達(dá)顯著降低，如 LCA 中的 E8。擾動(dòng)流誘導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞 E8 簇中基因的表達(dá)，這些基因在 VSMCs（Acta2 和 Tagln）、成纖維細(xì)胞（Dcn1）和免疫細(xì)胞（Cd74、H2-Eb1、H2-Aa 和 H2-Ab1）中也高度表達(dá)，表明內(nèi)皮細(xì)胞在血流紊亂條件下可能發(fā)生EndMT并獲得免疫細(xì)胞樣特征。通過(guò) Panther 基因本體分析比較穩(wěn)定流暴露的 E2 和擾動(dòng)流暴露的 E8 簇之間的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)擾動(dòng)流誘導(dǎo)許多與促動(dòng)脈粥樣硬化通路相關(guān)的已知生物過(guò)程，包括炎癥、EndMT、細(xì)胞凋亡、血管生成和內(nèi)皮通透性。偽時(shí)間軌跡分析和其他差異基因表達(dá)和染色質(zhì)可及性分析證實(shí)，E8 細(xì)胞比 E2 細(xì)胞表達(dá)更高水平的 EndMT（Acta2、Cnn1、SnAI1 和 Tagln）和 EndIT（C1qa、C1qb、C5ar1 和 Tnf） 標(biāo)記基因。此外，體外培養(yǎng)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)期暴露于擾動(dòng)流誘導(dǎo)了 EndMT 標(biāo)志物（SNAI1 和 TAGLN）和 EndIT 標(biāo)志物（C1QC 和 C5AR1）的表達(dá)，表明擾動(dòng)流可以在沒(méi)有任何其他細(xì)胞類型（如免疫細(xì)胞）的情況下誘導(dǎo)培養(yǎng)的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞重編程。這些結(jié)果表明，紊亂的血流誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇賱?dòng)脈粥樣硬化表型，其特征是炎癥、EndMT 和 EndIT（即 FIRE）（圖4）。

圖4 單細(xì)胞 RNA 測(cè)序顯示受擾動(dòng)流誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞重編程。

總之，來(lái)自血流的剪切應(yīng)力有效調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的表型和功能變化，從而阻止或促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成。內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)介導(dǎo)各種機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的機(jī)械傳感器轉(zhuǎn)導(dǎo)這些生物力學(xué)線索，進(jìn)而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組變化以及細(xì)胞功能。高通量組學(xué)結(jié)合體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某霈F(xiàn)揭示了許多調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的血流敏感基因、蛋白質(zhì)和通路。穩(wěn)定血流誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)性內(nèi)皮細(xì)胞表型，而血流紊亂誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化表型，其特征是內(nèi)皮形態(tài)和屏障功能改變、內(nèi)皮代謝受損、氧化還原調(diào)節(jié)、增殖和細(xì)胞凋亡、炎癥途徑誘導(dǎo)以及轉(zhuǎn)分化為其他細(xì)胞類型，例如 EndMT。此外，體內(nèi) scRNA-seq 和 scATAC-seq 研究表明，擾動(dòng)流不僅會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)皮炎癥和 EndMT，還會(huì)誘導(dǎo) EndIT，研究人員將其定義為 FIRE（血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞重編程）。FIRE 在內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化中的機(jī)制和作用是未解之謎，調(diào)節(jié) FIRE 的血流敏感分子可能是新的治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Tamargo IA, Baek KI, Kim Y, Park C, Jo H. Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis. Nat Rev Cardiol. 2023 Nov;20(11):738-753. doi: 10.1038/s41569-023-00883-1. Epub 2023 May 24. PMID: 37225873; PMCID: PMC10206587.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37225873/

1759-5002 (print) and 1759-5010 (online).

Journal Impact Factor: 41.7

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