吸煙是全球范圍內導致可預防死亡和疾病的主要原因之一，每年約有800萬人因此喪生。吸煙與50多種疾病相關，包括心血管疾病、肺癌和癡呆等。傳統的吸煙評估方法主要依賴于自我報告的問卷數據，如吸煙包年（smoking pack years ）或當前吸煙狀態，但這些方法容易受到回憶偏差的影響，且無法區分被動吸煙暴露。此外，常用的尼古丁生物標志物（如可替寧）半衰期較短（15-20小時），無法提供長期的吸煙暴露信息。因此，開發一種更客觀、長期的吸煙生物標志物具有重要意義。近年來，血液中的DNA甲基化模式被證明是吸煙的潛在長期生物標志物，因為其不僅反映吸煙狀態，還與累積煙草暴露量和戒煙時間相關。
 
近日，英國愛丁堡大學遺傳學與癌癥研究所Riccardo E. Marioni團隊通過結合血液和大腦樣本的表觀基因組關聯分析(EPIgenome-Wide Association Study,EWAS)，深入研究吸煙對DNA甲基化（DNAm）的影響，并開發一種新的表觀遺傳標記（mCigarette），用于更準確地評估吸煙行為及其健康影響。研究利用了多個英國隊列的數據，包括Generation Scotland（GS）、Lothian Birth Cohort 1936（LBC1936）和Avon Longitudinal Study of Parents and Children（ALSPAC），通過多種技術手段（如Illumina EPIC 850K芯片、TWIST人類甲基化面板和Oxford Nanopore測序）分析了吸煙與DNA甲基化之間的關聯。相關研究成果以《A blood- and brAIn-based EWAS of smoking》為題發表于Nature子刊《Nature Communications》（自然通訊）期刊。
 
標題：A blood- and brain-based EWAS of smoking（基于血液和大腦的吸煙表觀基因組關聯研究） 發表時間：2025年4月4日
發表期刊：Nature Communications
影響因子： IF14.7/Q1
技術平臺：EWAS等

DNA甲基化提供了一種客觀評估吸煙影響的方法。本研究對吸煙包年進行了貝葉斯（Bayesian）表觀基因組關聯研究（EWAS）（n=17865，850K芯片），并通過對來自蘇格蘭世代研究（Generation Scotland）的吸煙者和非吸煙者的全基因組數據（n = 46，通過TWIST和Oxford Nanopore測序技術檢測到約4M~21M位點）進行擴展分析。研究開發了一種名為mCigarette的吸煙表觀遺傳生物標志物，并在兩個英國隊列中對其進行測試。在大腦和血液樣本中進行的EWAS結果（大腦n=14，血液n=882，450K芯片）揭示多個可以區分吸煙狀態的位點，且這些位點在不同組織之間并不重疊。此外，研究人員還進行了表觀遺傳吸煙的全基因組關聯研究（GWAS），鑒定出多個與吸煙相關的位點。總體而言，通過整合多個組織和隊列的DNA甲基化數據，可以提高吸煙相關生物標志物的準確性，并增強對吸煙影響的理解。

研究方法
使用三個英國隊列數據：
Generation Scotland (GS)：17865名志愿者的吸煙包年數據和Illumina 850K芯片的DNA甲基化數據。
Lothian Birth Cohort 1936 (LBC1936)：882名參與者的血液DNA甲基化數據（850K芯片）和14名參與者的五個腦區（海馬、背外側前額葉皮層、初級視覺皮層、前扣帶皮層和腹側/外側顳下皮層）的DNA甲基化數據。
Avon Longitudinal Study of Parents and Children (ALSPAC)：多個時間點的DNA甲基化數據，用于驗證mCigarette標記的性能。

研究方法
EWAS分析：使用貝葉斯方法對GS隊列中的17865名個體進行吸煙包年與DNA甲基化位點的EWAS分析。
高分辨率EWAS分析：對46名吸煙者和非吸煙者（來自GS隊列）進行高分辨率的DNA甲基化分析，使用TWIST人類甲基化面板（約4M CpG位點）和Oxford Nanopore Technologies(ONT)測序（約21M CpG位點）。
mCigarette生物標志物開發：基于GS隊列的甲基化芯片數據，通過彈性網絡回歸開發mCigarette生物標志物，并在LBC1936和ALSPAC隊列中驗證其性能。
組織特異性分析：在LBC1936隊列的五個腦區中分析吸煙與DNA甲基化的關聯。
GWAS分析：對GS隊列中的17105名個體進行自我報告吸煙和表觀遺傳吸煙（基于GrimAge DNAm包年）的全基因組關聯研究（GWAS）。
 
結果圖形
（1）吸煙的EWAS分析
在GS隊列的17865名個體中，研究發現DNA甲基化可以解釋50.0%的吸煙包年表型變異。42個獨立的CpG位點與吸煙顯著相關，其中26個位點的關聯概率>95%。這些位點中，33個在之前的EWAS目錄中被報告過，而9個未被報告的位點可能與神經發育和成癮相關。
 
圖1：項目概述
  本研究使用三個英國隊列的數據： GS隊列、LBC1936隊列、ALSPAC隊列。所有三個隊列均提供基于血液的DNA甲基化（DNAm）數據，而LBC1936還包含14名個體的五個腦區死后腦組織的DNAm水平信息。在GS中進行吸煙的貝葉斯表觀基因組關聯研究（EWAS）（850K芯片）。GS的23對年齡和性別匹配的吸煙者和非吸煙者，采用高分辨率甲基化測量方法（TWIST分析4M位點；ONT測序21M位點），隨后進行EWAS分析。在GS中開發了一種吸煙的表觀遺傳生物標志物mCigarette，并在LBC1936中將其作為自我報告吸煙的預測因子進行測試。mCigarette與自我報告吸煙的關聯在ALSPAC中的多個年齡組中得到復制。接下來使用LBC1936的芯片DNAm數據，對14名個體的五個腦區進行吸煙的EWAS分析。最后，在GS中進行了全基因組關聯研究（GWAS），以比較自我報告吸煙和表觀遺傳吸煙（GrimAge DNAm包年評分）的遺傳信號。
 
（2）吸煙的高分辨率 EWAS分析
在46名個體中，使用TWIST和ONT測序技術的高分辨率EWAS分析揭示了更多與吸煙相關的CpG位點。TWIST分析揭示了33個顯著位點，其中2個位點在之前的EWAS目錄中被報告過。ONT測序分析在相同閾值下揭示了9個顯著位點，其中1個位點在之前的EWAS目錄中被報告過。這些位點與多種基因相關，涉及癌癥和神經發育障礙。
  圖2：GS隊列研究中現吸煙者與從未吸煙者的EWAS分析（n=23對）。
  本研究使用三種DNA甲基化數據進行分析：850K芯片、TWIST（4M CpG位點，靶向短讀長測序）和ONT測序（2100萬個CpG位點，長讀長測序）。圖中的X軸表示1-22號染色體，Y軸表示-log10(P值)。圖中頂部的水平線標記了全基因組顯著關聯，底部的水平線表示提示性顯著性閾值。虛線突出顯示了與吸煙狀態相關位點。
 
（3）吸煙相關的DNAm生物標志物：mCigarette
研究開發了mCigarette生物標志物，通過彈性網絡回歸從17865名GS個體中篩選出1255個CpG位點。在LBC1936隊列中，mCigarette能夠非常好地區分當前吸煙者、前吸煙者和從未吸煙者（AUC=0.98）。與之前開發的表觀遺傳標記相比，mCigarette在預測吸煙狀態方面表現更好。
  圖3：吸煙表觀遺傳生物標志物（mCigarette）的預測性能
  圖中顯示的曲線下面積（AUC）代表模型區分以下吸煙類別的能力：藍色表示現吸煙者與從未吸煙者的區分，橙色表示現吸煙者與前吸煙者的區分，綠色表示前吸煙者與從未吸煙者的區分。
  表1：mCigarette與六種吸煙生物標志物的對比基準測試：AHRR（cg05575921）血液DNAm水平的單一位點生物標志物、EpiSmokEr、BayesR評分、由McCartney等人開發的評分、GrimAge、mCigarette。

（4）組織特異性
在LBC1936隊列的五個腦區中，研究發現吸煙與DNA甲基化的關聯具有組織特異性。例如，cg05575921（AHRR基因）在血液中是吸煙狀態的強標記，但在海馬區中無法區分吸煙狀態。而cg26381592（PMS1基因）在海馬區中與吸煙狀態強相關，但在血液中無法區分吸煙者。
  圖4：不同自我報告吸煙類別下的血液和腦組織中CpG甲基化水平。  
（5）自我報告和表觀遺傳吸煙的GWAS分析
在GS隊列的17105名個體中，自我報告吸煙包年的GWAS分析發現了一個顯著的SNP（rs117836409，位于GDPD1基因），而基于GrimAge DNAm包年的GWAS分析發現了39個SNP（位于兩個基因風險位點）。這些位點中，rs1800440（CYP1B1基因）和rs6495309（CHRNA3-CHRNB4基因）與吸煙相關疾病和尼古丁依賴相關。這些結果表明，表觀遺傳吸煙標記可能比自我報告吸煙更能檢測到顯著的遺傳位點。
  圖5：各種全基因組關聯研究（GWAS）之間重疊的曼哈頓圖
  研究的表型包括：GS隊列的吸煙包年（n=17105）、Erzurumluoglu 等人迄今為止最大的薈萃分析的吸煙包年（n=131892）、基于GrimAge的吸煙包年（n = 17105）的DNA甲基化（DNAm）分析。
 
易小結
本研究通過整合多個組織和隊列的DNA甲基化數據進行EWAS分析，顯著提高了對吸煙與DNA甲基化關系的理解，并開發了一種新的表觀遺傳標記（mCigarette），能夠更準確地評估吸煙行為。研究結果表明，吸煙對不同組織的DNA甲基化模式有差異化的影響，這些差異可能與吸煙相關的疾病機制有關。此外，表觀遺傳吸煙標記的GWAS分析與自我報告吸煙的GWAS分析結果部分重疊，表明表觀遺傳標記可能捕捉到更廣泛的生物學影響。本研究結果為未來吸煙相關疾病的研究和干預提供了新的工具和視角。未來的研究可以進一步探索表觀遺傳標記在不同人群中的應用，并深入研究吸煙對健康影響的分子機制。

EWAS分析在本研究中的重要作用
EWAS分析在本研究中起到了關鍵作用，通過全表觀基因組關聯研究，研究者能夠系統地鑒定與吸煙相關的DNA甲基化位點。這些位點不僅揭示了吸煙對DNA甲基化的長期影響，還為開發新的表觀遺傳標記（如mCigarette）提供了基礎。此外，EWAS分析還揭示了吸煙對不同組織DNA甲基化的差異化影響，為理解吸煙相關疾病的分子機制提供了重要線索。