雙光子探針在生物醫(yī)學成像領域的創(chuàng)新應用_abio生物試劑品牌網
在生物醫(yī)學研究的微觀世界里，成像技術無疑是科學家們洞察生命奧秘的“眼睛”。從早期的光學顯微鏡到如今的前沿成像手段，每一次技術的躍遷都為我們揭開了生命活動更精細、更深層的面紗。雙光子顯微鏡（TPM）作為新一代的成像利器，以其獨特的物理原理和卓越的性能，在生物醫(yī)學領域掀起了一場成像革命。雙光子顯微鏡采用近紅外光子作為激發(fā)源，利用兩個低能光子同時被吸收來激發(fā)熒光分子，這一過程具有空間局域性，能夠實現(xiàn)高分辨率的三維成像，同時減少光漂白和光毒性，為活體組織的長期觀察提供了可能。
研究背景與技術挑戰(zhàn)
光學成像技術的局限性
光學成像技術在生命科學研究中扮演著舉足輕重的角色。傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡雖能實現(xiàn)細胞水平的熒光成像，卻受限于紫外-可見光（UV-Vis）單光子激發(fā)方式。這種激發(fā)模式下，光子穿透組織深度有限，易受組織自身熒光干擾，且連續(xù)激光易造成光漂白和光毒性，損害生物樣本。這些局限性嚴重制約了科學家們對生物體內深處結構和動態(tài)過程的觀察。
雙 光子顯微鏡應運而生，它采用近紅外光（ NIR，700-1100nm）的兩個低能光子作為激發(fā)源。該技術優(yōu)勢顯著：一是近紅外光子穿透力強，可深入組織內部，突破傳統(tǒng)成像深度極限，實現(xiàn)對活體組織深層次結構的成像；二是 雙 光子激發(fā)具有空間局域性，可實現(xiàn)三維成像，提升分辨率，減少背景干擾；三是飛秒脈沖激光總能量低，有效降低光漂白和光毒性，有利于對活細胞和組織的長期觀察。這些優(yōu)勢使 雙 光子顯微鏡在神經科學、細胞生物學、發(fā)育生物學等多個領域展現(xiàn)出巨大潛力。
高效探針研發(fā)的瓶頸
然而，目前雙光子探針的研發(fā)仍面臨諸多挑戰(zhàn)。理想的探針需具備高選擇性、良好水溶性、細胞通透性、大雙光子作用截面、高光穩(wěn)定性及低毒性等特性，以滿足多樣化的生物醫(yī)學需求。探針是雙光子顯微鏡成像的關鍵，它直接決定了成像的特異性和靈敏度。但兼具這些性能的探針研發(fā)難度極大，這在很大程度上限制了雙光子顯微鏡的廣泛應用。現(xiàn)有探針在生物靶點的選擇性、成像深度、信號強度等方面仍存在不足，難以滿足復雜生物環(huán)境下的高精度成像需求。
技術創(chuàng)新與應用
脂筏成像探針的突破
為攻克探針研發(fā)難題，科研團隊展開深入研究。在脂筏成像方面，針對傳統(tǒng)探針在細胞中表現(xiàn)不佳的問題，研究人員開發(fā)出C-laurdan（CL）。這一改進顯著提升了探針水溶性，使其在不同類型脂質環(huán)境中均能精準反映脂筏和非脂筏區(qū)域，克服了傳統(tǒng)探針的局限性。CL在細胞膜中展現(xiàn)出良好的平行排列，其熒光發(fā)射峰在不同脂質環(huán)境中的變化與脂筏的物理狀態(tài)高度相關，為脂筏的可視化提供了可靠工具。實驗結果表明，CL標記的細胞在經過處理破壞脂筏后，其GP曲線發(fā)生顯著變化，高GP值部分明顯下降，而低GP值部分保持穩(wěn)定，這一結果與脂筏破壞引起的細胞膜物理性質改變高度一致，確證了CL對脂筏的精準標識能力。
進一步地，團隊又研發(fā)了CL2和SL2雙光子開啟探針。CL2在脂筏中特異性發(fā)射熒光，成像背景清晰。實驗顯示，CL2標記的巨噬細胞在MβCD處理后熒光信號消失，而補充膽固醇又可使其恢復，且與商業(yè)脂筏探針成像結果高度吻合。SL2則憑借磺酸基團的親水性，減少細胞內攝取，更適用于長期成像。SL2在293T細胞和新鮮大鼠海馬腦片成像中，展現(xiàn)出對細胞膜脂筏的清晰標記，且細胞內攝取極少，為活體組織脂筏研究提供了可靠手段。SL2標記的大鼠海馬腦片TPM圖像清晰地展現(xiàn)了CA1和CA3區(qū)域以及齒狀回的脂筏分布，即使在約100μm的深度，仍能分辨出細胞膜上的亮區(qū)，這些亮區(qū)在MβCD處理后消失，進一步驗證了SL2對脂筏的特異性。
細胞器成像探針的創(chuàng)新在細胞器成像領域，團隊開發(fā)出針對溶酶體和線粒體的 雙 光子探針。用于溶酶體的 兩種 探針 （ CLT-blue和CLT-yellow ） ，以及分別針對線粒體和溶酶體的 BLT-blue和FMT-green探針，均展現(xiàn)出優(yōu)異的成像性能。這些探針發(fā)射波長不同，可實現(xiàn)雙色成像，同時具備高光穩(wěn)定性、低細胞毒性和抗pH變化的特性。 兩種 探針的發(fā)射峰分別為 470nm和550nm，雙光子作用截面分別為50GM和47GM，能夠在較低激光功率下產生明亮的熒光信號。實驗中，這兩種探針標記的HeLa細胞，其TPM圖像與溶酶體的光學成像結果高度重合，而與高爾基體和線粒體無重疊，證明了其對溶酶體的特異性標記能力。
兩種探針的雙光子作用截面分別為160GM和175GM，具有較高的亮度和穩(wěn)定性。在RAW264.7細胞中，這兩種探針分別對線粒體和溶酶體進行標記，TPM圖像與光學成像結果一致，且在生物相關pH范圍內不敏感，可長期穩(wěn)定成像。實驗結果顯示，在饑餓處理2小時后，溶酶體和線粒體的共定位系數(shù)顯著增加，這與自噬過程中線粒體被溶酶體降解的生物學機制高度吻合。
pH測量探針的開發(fā)此外，針對胃食管反流病（GERD）等與pH變化相關的疾病診斷難題，團隊研發(fā)出比率型雙光子pH探針NP1。NP1在不同pH值下藍綠熒光發(fā)射強度比值（Iblue/Igreen）發(fā)生顯著變化，可實現(xiàn)組織內部pH值的精準測量。實驗表明，NP1的Iblue/Igreen比值隨pH值的降低而增加，覆蓋pH2.45至6.50的廣泛范圍，且該比值與pH值呈良好的線性關系。動物實驗與人體組織測試表明，NP1能有效區(qū)分正常組織與病變組織的pH差異。在對胃食管組織的成像中，NP1可以從90-180μm深度獲取組織pH值，為GERD病理研究和非侵蝕性胃食管反流病（NERD）診斷提供了關鍵數(shù)據(jù)支持。
成像實驗與結果分析
脂筏成像實驗
SL2在293T細胞和新鮮大鼠海馬腦片成像中，展現(xiàn)出對細胞膜脂筏的清晰標記，且細胞內攝取極少。SL2標記的大鼠海馬腦片TPM圖像清晰地展現(xiàn)了CA1和CA3區(qū)域以及齒狀回的脂筏分布，即使在約100μm的深度，仍能分辨出細胞膜上的亮區(qū)，這些亮區(qū)在MβCD處理后消失，進一步驗證了SL2對脂筏的特異性。這些實驗結果表明，新型脂筏探針在細胞和組織水平上均能實現(xiàn)對脂筏的精準成像，為研究細胞膜的結構與功能提供了有力工具。
細胞器成像實驗
對于細胞器成像，兩種探針標記的HeLa細胞，其TPM圖像與溶酶體的光學成像結果高度重合，而與高爾基體和線粒體無重疊。兩種探針在RAW264.7細胞中成像效果與溶酶體和線粒體的光學成像結果一致。在自噬實驗中，經雷帕霉素誘導自噬后，TPM圖像顯示溶酶體熒光增強、線粒體熒光減弱，且二者融合程度隨時間增加。這一過程直觀展現(xiàn)了自噬過程中線粒體被溶酶體降解的動態(tài)過程。在組織成像中，這兩種探針在120μm深度處仍能清晰分辨溶酶體和線粒體分布，TPM圖像顯示二者在組織中的分布特征與預期一致，且在不同區(qū)域的分布差異也能被清晰捕捉，為研究細胞器在組織中的相互作用和功能提供了重要依據(jù)。
NP1探針在人體胃食管組織成像中表現(xiàn)出色，可從90-180μm深度獲取組織pH值。實驗測得胃部pH值約為2.1，正常與食管炎患者的胃部pH值接近，但在胃食管連接處和食管下括約肌上方5cm處，食管炎患者的pH值顯著低于對照組。這一結果與GERD的病理特征相符，即食管腔內酸性環(huán)境增強是GERD發(fā)病的關鍵因素。此外，NP1探針對不同深度組織的pH測量結果顯示，盡管組織紋理略有變化，但pH值測量結果穩(wěn)定，表明該探針在組織內部具有良好的滲透性和穩(wěn)定性，能夠提供準確的pH值信息。這些實驗數(shù)據(jù)為GERD的病理研究和NERD的診斷提供了重要依據(jù)，也為未來開發(fā)基于雙光子探針的臨床診斷技術奠定了基礎。
總結與展望
雙光子探針的技術革新，標志著生物醫(yī)學成像從“結構觀察”邁向“功能解析”的新階段。通過分子設計優(yōu)化，CL、SL2等探針成功克服了傳統(tǒng)工具的靈敏度與特異性瓶頸，而雙色系統(tǒng)則為細胞器互作研究提供了動態(tài)窗口。NP1的臨床驗證更是證明，雙光子技術有望從實驗室走向病床，成為疾病早期診斷的有力工具。隨著探針庫的擴充與成像系統(tǒng)的微型化，雙光子技術或將在腫瘤免疫治療、神經環(huán)路解析及個性化醫(yī)療中發(fā)揮更核心的作用。
聲明：本文僅用作學術目的。
Lim CS, Cho BR. Two-photon probes for biomedical applications. BMB Rep. 2013 Apr;46(4):188-94.
DOI:10.5483/bmbrep.2013.46.4.045.
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