結直腸癌（CRC）是全球發病率第三、癌癥死亡率第二的癌癥，手術、放療和化療是其主要治療方法，但放化療的非特異性細胞毒性常導致顯著副作用。近年來，新抗原在癌癥免疫治療中顯示出關鍵作用，其特異性T細胞的功能和數量影響免疫檢查點阻斷療法的療效，新抗原疫苗和T細胞輸注也表現出良好效果。新抗原是腫瘤中由基因突變產生的免疫肽，通過人類白細胞抗原（HLA）呈遞，具有免疫原性并可激活T細胞介導的靶細胞殺傷。此外，CRC腫瘤中存在大量細菌，其來源的肽在多患者中被檢測到并具有免疫原性。然而，目前關于CRC免疫肽組的研究較少，明確鑒定的表位有限，且腫瘤內細菌對免疫肽組的影響尚不清楚。     今天為大家分享一篇2024年6月發表在Pharmacological Research上的文章，文章的題目是“Proteogenomic analysis identifies neoantigens and bacterial peptides as immunotherapy targets in colorectal cancer”。作者采用了一種包括全外顯子測序（WES）、16S核糖體DNA（rDNA）測序和免疫肽組學在內的蛋白質基因組學策略，系統地分析了CRC組織的免疫肽組，并鑒定了一系列免疫原性新抗原和細菌表位。單細胞TCR測序獲得了表位反應性T細胞的高頻TCRαβ序列，TCRαβ的轉導可以賦予T細胞識別呈遞表位的靶細胞的能力，為CRC免疫治療提供了潛在的靶點。   實驗方法 本研究從8名結直腸癌患者中收集腫瘤組織和正常組織樣本，并從患者血液中分離外周血單個核細胞（PBMCs）。通過全外顯子測序（WES）分析腫瘤組織和PBMCs的DNA，以檢測基因突變；利用16S核糖體DNA（rDNA）測序分析腫瘤組織中的細菌組成。采用免疫肽組學方法，從腫瘤組織中提取HLA-I結合的肽段，并通過液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）進行分析，以鑒定新抗原和細菌肽。通過質譜數據分析軟件對鑒定的肽段進行分析，并結合WES結果建立個性化的新抗原數據庫。此外，通過ELISpot實驗和流式細胞術評估候選肽段的免疫原性，并利用單細胞TCR測序分析表位反應性T細胞的TCR庫。最后，構建TCR-T細胞，并評估其對特定表位的反應性，以驗證這些靶點在免疫治療中的潛力。 實驗結果
1. 結直腸癌免疫肽組的深入分析 使用 PEAKS X Pro 軟件對8個結直腸癌原發腫瘤和6個正常組織樣本的免疫肽組進行了全面分析，共鑒定出74679個HLA-I結合肽段，其中23915個為結直腸癌特異性免疫肽。這些肽段主要為9-11個氨基酸長度，與整體免疫肽組特征一致。作者通過WES獲得了每位患者的HLA-I分型信息，使用NetMHCPan4.1在線分析每個樣品中的肽親和力。預測平均81.3%的肽HLA-I結合。通過與正常組織的比較，發現腫瘤和正常組織之間有47.1%的免疫肽是共享的。   圖1. CRC免疫肽組分析 2. 來自癌癥睪丸抗原（CTAs）的表位 CTA由過表達并廣泛存在于腫瘤中的抗原組成，包括癌胚抗原和各種癌癥睪丸抗原蛋白，許多CTA表位已被確定為抗腫瘤靶點。作者利用276個已知的CTAs列表在樣本中搜索CTA肽段，發現大多數CTAs在腫瘤和正常組織中均能產生免疫肽。作者繪制了每個樣品中鑒定的CTAs肽的熱圖，結果顯示大多數CTA在腫瘤和正常組織中都產生免疫肽，通過比較，最終在6個腫瘤樣本中鑒定出23個來自15個CTAs的結直腸癌特異性免疫肽，其中2個被證實具有免疫原性。   圖2.鑒定CTA表位 表1. CTA抗原表位鑒定 3. 結合測序數據鑒定新生抗原和細菌肽 作者為每位患者構建了包含突變蛋白的個性化數據庫，最終在3個結直腸癌樣本中鑒定出4個新抗原。通過16S rDNA測序分析了4對結直腸癌樣本中的腫瘤內細菌組成，構建了個性化的細菌數據庫（細菌豐度>0.5%），并將其與人類蛋白質組數據相結合，以鑒定腫瘤細胞上呈現的細菌肽。該分析顯示腫瘤中有45-133個細菌肽，正常組織中有12-91個細菌肽。通過比較癌組織和正常組織的細菌肽數據，發現癌癥組織和癌旁組織之間的細菌肽相似性非常低，與經典的免疫肽組明顯不同，具有8個氨基酸的肽的比例較高，細菌肽的結合比例顯著低于經典免疫肽。根據預測的免疫原性評分和MS/MS譜圖的質量，選擇了其中8種肽進行功能驗證。來源于B. fragilis的B2和B5肽分別由兩名患者共享。   表2. CRC新抗原鑒定   表3. CRC細菌肽鑒定   4. 使用自體的PBMC驗證新抗原和細菌肽 研究人員合成了4個新抗原、3個野生型肽段和8個細菌肽段，并通過比較內源性和合成肽段的保留時間和MS/MS譜圖進行驗證。結果顯示，3個新抗原和6個細菌肽段在內源性和合成肽段之間具有相似性。進一步的體外刺激實驗表明，4個新抗原和5個細菌肽段能夠激活自體T細胞，導致IFN-γ分泌。細菌肽方面，B2和B5分別由2例患者共享。B2能夠激活T3的T細胞，B5能夠激活T6、T8的T細胞。總之，通過蛋白質基因組學策略鑒定的候選肽中有75%具有免疫原性，可能作為抗腫瘤靶標。   圖3. 鑒定的新抗原和細菌肽的免疫原性分析 5. 抗原表位TCR鑒定 在通過IFN-γ ELISpot實驗確定了表位的免疫原性之后，研究發現肽段T7-N1、T8-N1和B5能激活T細胞，導致CD137表達上調。為了研究表位特異性T細胞的TCR序列，并通過單細胞TCR測序鑒定出對特定表位有反應的主導TCRαβ克隆型。研究發現，與表位共培養后，反應性T細胞的主導TCRαβ 克隆型顯著擴增。通過構建慢病毒載體并轉導健康供體的T細胞，成功獲得了特異性識別B5肽的TCR-T細胞，并驗證了其對靶細胞的特異性反應性。   圖4. 抗原特異性TCR鑒定與驗證 結論 本研究通過蛋白質基因組學策略全面分析了結直腸癌（CRC）患者的免疫肽組，成功鑒定出多個CRC特異性的新抗原和細菌肽，這些新抗原和細菌肽能夠被患者的自體T細胞識別并引發免疫反應。研究還通過單細胞TCR測序揭示了表位反應性T細胞的TCR庫，并成功構建了能夠特異性識別這些表位的TCR-T細胞。這些發現不僅為CRC的個性化免疫治療提供了新的靶點，還為開發新的免疫治療策略，如新抗原疫苗和TCR-T細胞療法，提供了重要的科學依據和潛在的應用方向。