E2F1-induced autocrine IL-6 inflammatory loop mediates cancer-immune crosstalk that predicts T cell phenotype switching and therapeutic responsiveness

Keywords: CD4 +/CD8 + T cells; E2F1-STAT3/IL-6 network; Th2-Th1 shift; cancer metastasis; immunomodulation; mathematical modeling; melanoma secretome; tumor microenvironment.

黑色素瘤是一種發病率越來越高的皮膚癌，一旦達到轉移階段就會發病。一般來說，它被認為是一種免疫原性腫瘤，表達幾種腫瘤特異性以及腫瘤相關抗原。已在很大一部分患者中檢測到腫瘤特異性 T 細胞反應。此外，腫瘤特異性 T 細胞的過繼轉移可以介導轉移性黑色素瘤患者的持久反應。最近，免疫檢查點抑制劑（ICI）徹底改變了晚期黑色素瘤的治療，在近 50% 的患者中實現了腫瘤消退和持久的癌癥控制。這些高緩解率強調了該腫瘤實體的免疫原性。

黑色素瘤病理學中的一個關鍵表觀遺傳參與者是 E2F1 轉錄因子。除了作為細胞周期、代謝的調節因子或通過誘導細胞凋亡來響應DNA損傷的腫瘤監視因子的生理作用外，大量高表達的E2F1還刺激黑色素瘤和其他幾種腫瘤的轉移轉化。這種轉錄因子（TF）通過促進上皮-間充質轉化（EMT）、新血管生成、外滲和基因組不穩定來協調轉移擴散，預測疾病惡化和不良患者預后。

為了探索 E2F1 在侵襲性黑色素瘤細胞存在下的免疫調節中的作用，德國羅斯托克大學醫學中心及埃爾朗根-紐倫堡大學腫瘤免疫學實驗室研究團隊在一項實驗中建立了一個共培養系統，并利用轉錄組和細胞因子陣列結合生物信息學和結構建模，確定了一個以 IL6 為中心樞紐的 E2F1 依賴性基因調控網絡。研究成果發表于 Frontiers in Immunology 期刊題為“E2F1-induced autocrine IL-6 inflammatory loop mediates cancer-immune crosstalk that predicts T cell phenotype switching and therapeutic responsiveness”。
首先，為了進行基因表達分析，使用人類黑色素瘤組織培養模型，該模型由具有特征性侵襲/轉移潛力的不同細胞系組成，這些細胞系顯示 E2F1 水平與細胞運動呈正相關（圖1 B）。在侵襲性細胞系中敲低 E2F1 后，揭示了 3687 個顯著差異表達基因（DEGs）（圖1 C）。在 DEGs 上應用 GSEA 表明，在黑色素瘤中敲低 E2F1 后，EMT 和炎癥反應的基因集受到抑制（圖1 D），這意味著 E2F1 調控基因的多效性結合了其促轉移和免疫調節活性。值得注意的是，在比較來自兩個標志集的富集基因后，IL6 成為唯一的候選基因（圖1 E）。

將來自 Transfac 和免疫相關基因的列表與轉錄組數據相結合，確定了 165 個顯著下調的基因，這些基因可能對免疫調節有影響（圖1 F）。對已鑒定基因的 STRING 分析表明，存在高度互連的網絡，包括 E2F1、MYC、CD274（PD-L1）、EZH2 和 IL6（圖1 G）。有趣的是，IL6 在 E2F1 消融后表現出最強烈的下降（圖1 C），在與細胞因子介導的信號傳導、Th2 細胞因子產生和細胞遷移調控相關的基因表達亞簇中占據中心樞紐位置（圖1 H）。這些數據支持，E2F1 與免疫調節之間的功能聯系，并強烈表明 IL-6 是該轉錄因子發揮免疫調節活性的關鍵因子。隨后對 IL-6 表達和分泌的分析清楚地驗證了其與內源性 E2F1 表達的正相關（圖1 I）。進一步檢測侵襲性黑色素瘤細胞中 E2F1 和 IL-6 以及間充質或上皮細胞標志物的表達，并分析它們的相關性（圖1 J-L），發現IL-6 通過增強黑色素瘤細胞的 EMT 和侵襲性來促進 E2F1 誘導的轉移。

為了進一步評估 IL6 的轉錄調控，使用 ChIP-seq 數據篩選 IL6 基因上游 10,000 bp 的片段來搜索 E2F1 結合簇，并在翻譯起始位點近端的轉錄活性區域中心發現了一個主要的 E2F1 簇。值得注意的是，該區域還包含一個 STAT3 簇。據報道，STAT3 和 E2F1 可以根據細胞環境產生轉錄協同作用，研究結果也證實了 E2F1 和 STAT3 對 IL6 啟動子的協同增強作用。

圖1 轉移性黑色素瘤中鑒定 E2F1 誘導的免疫調節網絡。

由于 E2F1 通過 IL-6 協調免疫調節網絡（圖1 G），因此，接下來研究了 IL-6 對癌癥免疫串擾的影響，建立一個間接共培養系統，將高表達 E2F1 與 E2F1敲低（E2F1-KD）黑色素瘤細胞系以單一培養的形式或與來自健康供體的 CD4 + 或 CD8 + T 細胞共培養（圖2 A）。通過活/死染色驗證共培養的黑色素瘤和免疫細胞的活力（圖2 B）。

與單一培養的 CD8+（左圖）或 CD4+（右圖）T 細胞相比，轉移性黑色素瘤細胞在上清液中顯示出高濃度的 IL-6（圖2 C）。重要的是，當腫瘤細胞和免疫細胞一起培養時，IL-6 水平顯著增加，這表明黑色素瘤和 T 細胞之間存在正反饋回路。盡管 E2F1 的缺失主要抵消了這種作用，但 IL-6 在共培養條件下仍然可以檢測到，并且只能通過直接抑制來降低。事實上，在 T 細胞存在的情況下，聯合IL-6 抑制劑和 E2F1-KD 處理以降低升高的細胞因子水平是必要的（圖2 C），而不影響細胞活力。

由于 E2F1 對腫瘤細胞中 GRNs 的影響以及觀察到的 IL-6 分泌的有趣變化，研究人員想知道黑色素瘤和 T 細胞的基因表達譜在多大程度上發生了改變，以及 E2F1-KD 是否可以在抗腫瘤免疫反應的意義上對 T 細胞的基因組程序產生積極影響。因此，對來自單培養和共培養實驗的腫瘤和免疫細胞進行了高通量陣列分析（圖2 A）。

來自共培養的 CD4 + T 細胞和人皮膚黑色素瘤細胞系 SK-Mel-147 對照與其相應的單一培養物的轉錄組的比較顯示，總共有 9453 個和 4521 個 DEGs（圖2 D），表明通過細胞因子介導的串擾，在富含E2F1的黑色素瘤和免疫細胞中強烈地誘導轉錄變化。值得注意的是，在共培養條件下，IL6 在黑色素瘤細胞中表達最強烈（圖2 D），這也驗證了圖中檢測到的 IL-6 分泌增加，并支持存在活性反饋回路。E2F1 敲低將兩種細胞類型中基因表達的這些變化嚴重分降低到 1462（CD4+）和 1708（SK-Mel-47 E2F1-KD）DEGs（圖2 E），強調了 E2F1 在腫瘤和免疫細胞之間的串擾中的調節作用。

為了進一步研究已鑒定基因的潛在生物學功能，對 DEGs（圖2 D）進行了 GO 富集分析，發現，與 SK-Mel-147 共培養的 CD4+ 中，1315 個上調基因主要與 T 細胞活化和 MHC-II 相關反應增加（即抗原加工和呈遞）等過程和通路相關（圖2 F），表明 T 細胞功能。相比之下，1662 個下調基因與單核細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞的趨化性有關（圖2 F），表明與先天免疫細胞的定向通訊受損。重要的是，該分析還揭示了與 IFN-γ 和 TNF-α 反應相關的基因抑制，這是已知可促進抗腫瘤反應的 CD4+ Th1 分化的兩個關鍵介質。這與與 Th1 發育相關的 ERK1/ERK2 通路相關基因的抑制一致（圖2 F）。在黑色素瘤細胞中，發現 331 個上調基因的抗原加工/呈遞和免疫反應的正調節得分很高（圖2 G），這與黑色素瘤的高度活躍免疫表型一致，而下調的基因主要參與神經元過程（圖2 G）。令人驚訝的是，在上調的免疫激活基因中，發現了幾種免疫抑制因子，如 CCL2，一種有效的 Th2 細胞趨化劑，以及檢查點抑制劑 CD274（圖2 G），如圖1 G 所示，它通過 IL6 簇連接到已識別的免疫調節 E2F1 網絡。

圖2 E2F1 依賴性串擾對黑色素瘤和 CD4 + T 細胞轉錄的影響。

考慮到 E2F1 通過 IL-6 的大幅上調和轉錄水平的變化對周圍環境的影響，使用 TIMER 2.0 數據庫分析了原發性和轉移性皮膚癌中 E2F1 的表達與免疫細胞腫瘤浸潤之間的潛在相關性。基于功能注釋和通路富集（圖2 F ），首先研究了單核細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的豐度。有趣的是，發現 E2F1 與原發性和轉移性患者樣本中的單核細胞呈有限的負相關（圖3 A、B）。然而，在兩個癌癥組中都沒有明顯的中性粒細胞或嗜酸性粒細胞的存在，證實了實驗之前的發現，即這些免疫細胞類型的趨化性相關基因下調（圖2 E）。

更重要的是，這些數據顯然支持 E2F1 及其靶點 IL-6 對 Th1/Th2 發育的強烈影響，如 Th2 細胞因子的產生、ERK1/2 通路的下調、IFN-γ反應或 CCL2 在黑色素瘤細胞中的表達。令人驚訝的是，E2F1 與原發腫瘤中的 Th2 浸潤呈顯著的正相關，而 IL6 沒有影響（圖3 C）。相比之下，轉移性樣本僅與 Th2 細胞表現出中等相關性，但也與 Th1 相關，這可能支持免疫刺激和免疫抑制機制的共現。然而，IL6 可以進一步促進 Th2，如晚期黑色素瘤中 Th2 豐度的增加和隨之而來的 Th1 細胞減少所表明的那樣（圖3 C）。這種轉變通過 E2F1 的輔因子 STAT3 的表達進一步放大，該輔因子 STAT3 持續抑制 Th1。此外，CD274 在原發性和轉移性腫瘤中同時阻斷 Th1 并促進 Th2 浸潤（圖3 D）。

為了驗證 E2F1 依賴性 Th2 轉移，使用從黑色素瘤免疫細胞共培養中獲得的上清液進行細胞因子陣列，特別關注 1 型和 2 型細胞因子（圖3 E、F），發現CD4+-SK-Mel-147 共培養的上清液顯示所有檢測到的 2 型細胞因子顯著增加，其中 IL-6 表現出最強的反應。引人注目的是，E2F1 的缺失導致大多數促炎蛋白的顯著減少，但不影響 1 型細胞因子（圖3 F）。與之前的數據一致，在高表達 E2F1 黑色素瘤共培養物中測得的 IL-6 水平急劇升高（圖3 E）在 E2F1-KD 下顯著降低（圖3 F）。這些結果提供了強有力的證據，表明 E2F1/IL-6 表達增加通過 2 型細胞因子觸發 Th2 驅動的炎癥，而 Th1 細胞活性受到抑制，建立了免疫抑制環境。

圖3 E2F1 對與 T 細胞共培養中免疫細胞浸潤和細胞因子釋放的影響。

由上述結果可知，STAT3 與 E2F1 共同參與 IL-6 表達，對黑色素瘤患者的 Th2/Th1 平衡起著關鍵作用。為了驗證分子機制和癌癥免疫串擾的動力學，研究人員最終推導出了一個基于核心腫瘤-免疫相互作用網絡的數學常微分方程（ODE）模型，該模型描述了 E2F1-STAT3/IL-6/IL6R 信號通路的激活以及 E2F1 和 STAT3 之間相互作用對 IL-6 轉錄調控的影響（自體和旁分泌激活；圖4 A ）。通過修改E2F1表達值的迭代模擬發現，在基礎 STAT3 激活下，黑色素瘤細胞中 E2F1 水平的增加可以觸發 IL-6 的表達和分泌（圖4 B）。模擬表明，黑色素瘤細胞高水平的 IL-6 分泌可以通過高水平的 E2F1、高水平的 STAT3 或中等水平的兩種 TFs 來實現（圖4 C）。

此外，還模擬了黑色素瘤分泌的 IL-6 對 TME 中存在的 CD4 + T 細胞的影響（圖4 A），表明高表達 E2F1 黑色素瘤細胞分泌的 IL-6 足以觸發 CD4+ 免疫細胞中 IL-6/IL6R/STAT3 軸的激活，這也可能觸發其他炎癥因子的分泌。重要的是，該模型在 IL-6 介導的自分泌激活誘導的 CD4+ 反應中顯示出超敏感性，因此能夠對患者數據進行以治療為導向的解釋。

圖4 黑色素瘤-CD4 + T 細胞與 E2F1-STAT3/IL-6/IL6R 軸串擾的數學模型和概述。

總之，該研究確定了一個以 IL6 為中心樞紐的 E2F1 依賴性基因調控網絡。E2F1 誘導的 IL-6 分泌釋放出自分泌炎癥反饋回路，驅動侵襲和上皮間質轉化。IL-6 激活的 STAT3 與 E2F1 物理相互作用，并通過結合 E2F1-STAT3 響應性啟動子元件協同增強 IL-6 表達。引人注目的是，E2F1 缺失減少了典型 2 型細胞因子的分泌，從而啟動了 Th2 到 Th1 表型向抗腫瘤免疫反應的轉變。這項研究解決了腫瘤相關微環境在調節免疫反應中的重要分子影響，并將為改進未來的癌癥治療做出重大貢獻。

參考文獻：SPItschak A, Dhar P, Singh KP, Casalegno Gardu?o R, Gupta SK, Vera J, Musella L, Murr N, Stoll A, Pützer BM. E2F1-induced autocrine IL-6 inflammatory loop mediates cancer-immune crosstalk that predicts T cell phenotype switching and therapeutic responsiveness. Front Immunol. 2024 Oct 31;15:1470368. doi: 10.3389/fimmu.2024.1470368. PMID: 39544930; PMCID: PMC11560763.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39544930/

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Electronic ISSN 1664-3224

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