DNA甲基化研究在揭示血管衰老的表觀調控機制中的應用_abio生物試劑品牌網
動脈粥樣硬化（Atherosclerosis）是一種慢性血管內膜疾病，是全球發病率和死亡率的主要原因之一。血管衰老是動脈粥樣硬化的主要風險因素之一，尤其是內皮細胞衰老在動脈粥樣硬化的早期階段就被觀察到，并參與其發病機制。近年來，研究表明表觀遺傳調控在血管衰老中發揮重要作用，但具體機制尚不清楚。S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine hydrolase，SAH）是一種強效的DNA甲基轉移酶抑制劑，其水平升高與心血管疾病風險增加有關。而S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（S-adenosylhomocysteine hydrolase，SAHH）的抑制會導致SAH水平升高，因此SAHH抑制是否加速血管衰老和動脈粥樣硬化進展是一個值得探索的問題。
近日，中山大學公共衛生學院營養學系凌文華教授團隊研究探討了抑制SAHH對血管衰老和動脈粥樣硬化的影響及其潛在機制。研究結果表明，抑制SAHH會導致血管內皮細胞衰老，并通過表觀遺傳調控促進線粒體分裂和活性氧（mtROS）水平升高，進而加速動脈粥樣硬化進展。研究結果揭示了SAHH在血管衰老和心血管疾病中的重要作用，并為相關疾病的預防和治療提供了新的靶點。相關研究成果以《EPIgenetic modulation of Drp1-mediated mitochondrial fission by inhibition of S-adenosylhomocysteine hydrolase promotes vascular senescence and atherosclerosis》為題發表于《Redox Biology》期刊。
標題：Epigenetic modulation of Drp1-mediated mitochondrial fission by inhibition of S-adenosylhomocysteine hydrolase promotes vascular senescence and atherosclerosis（通過抑制SAHH對Drp1介導的線粒體分裂的表觀遺傳調控促進血管衰老和動脈粥樣硬化）
發表時間：2023-7-25
發表期刊：Redox Biology
影響因子：IF10.7/Q1
技術平臺：WGBS、Target-BS等
本研究首先通過一項與血管衰老相關的病例對照研究顯示，血漿中SAH水平升高與血管衰老風險呈正相關，比值比（OR）為3.90（95%置信區間，1.17–13.02）。在32周齡的SAHH+/-小鼠的動脈中觀察到脈搏波速度升高、內皮依賴性舒張反應受損以及衰老相關β-半乳糖苷酶染色增加。此外，在體外和體內實驗中，抑制SAHH的血管內皮細胞表現出p16、p21和p53表達增加、線粒體分裂形態以及Drp1表達顯著上調。通過siRNA或其特異性抑制劑mdivi-1進一步下調Drp1，可以恢復異常的線粒體形態，并挽救血管衰老的表型。此外，在APOE-/-小鼠中抑制SAHH會促進血管衰老和動脈粥樣硬化進展，而這種作用可以通過mdivi-1治療得到緩解。從機制上講，SAHH抑制會導致人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中DRP1基因啟動子區域的低甲基化和DNA甲基轉移酶1（DNMT1）下調。
研究結果表明，SAHH抑制通過抑制DNA甲基化在內皮細胞中表觀遺傳性地上調Drp1表達，從而導致血管衰老和動脈粥樣硬化。這些結果表明，SAHH或SAH可以作為血管衰老和心血管疾病的潛在治療靶點。
圖形摘要
研究方法
病例對照研究：選取40-80歲的中老年人群，通過測量肱踝脈搏波速度（baPWV）確定病例組和對照組，分析血漿中SAH和SAM的水平。
動物實驗：使用SAHH雜合敲除小鼠（SAHH+/-）和載脂蛋白E缺陷小鼠（APOE-/-）模型，觀察SAHH抑制對血管衰老和動脈粥樣硬化的影響。
細胞實驗：在人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中通過抑制SAHH，觀察細胞衰老、線粒體分裂和活性氧（mtROS）水平的變化。
分子機制研究：通過基因表達分析、DNA甲基化測序（WGBS、Target-BS）等技術，探討SAHH抑制誘導血管衰老的分子機制。
研究結果
（1）血漿SAH水平與人群的血管衰老有關
在一項包含102名年齡和性別匹配的受試者的病例對照研究中，定義臂踝脈搏波速度 （baPWV）≥1400 cm/s為血管衰老。結果顯示，病例組的血漿SAH水平顯著高于對照組，而SAM/SAH比值則較低。血漿SAH水平與baPWV、頸動脈內膜中層厚度（cIMT）呈正相關，與血流介導的血管擴張（FMD）呈負相關。這表明SAH代謝與血管衰老之間存在相關性。
圖1：血漿SAH水平與人群血管衰老相關
（2）SAHH 抑制誘導血管衰老
在32周齡的SAHH+/-小鼠中，觀察到血漿SAH水平升高，SAM/SAH比值降低，并表現出血管衰老跡象，包括脈搏波速度（PWV）增加、內皮依賴性舒張功能受損以及主動脈中衰老相關β-半乳糖苷酶（SA β-gal）染色增加。此外，細胞衰老主要發生在內皮層。在體外實驗中，使用SAHH抑制劑腺苷二醛（ADA）或SAHH siRNA處理HUVECs，也觀察到SA β-gal染色增加和衰老標志物p16、p21、p53表達上調。
圖2：SAHH抑制誘導血管衰老。
（3）SAHH 抑制促進線粒體分裂并介導mtROS水平上調
鑒于SAHH抑制與DNA低甲基化相關，研究者對經SAHH抑制處理的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）進行全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）以進一步探究其機制。測序結果顯示與對照組相比，SAHH抑制組的整體甲基化水平降低。對測序數據集進行的GO富集分析表明，調節線粒體動態的基因可能介導了SAHH抑制誘導衰老的效果。
圖3： HUVECs細胞轉染SAHH-siRNA 48小時。
（A）基因組DNA甲基化測序示意圖。
（B）功能基因組區域中甲基化胞嘧啶相對密度的基因組特征。
（C）基于WGBS數據，對NC-siRNA組和SAHH-siRNA組之間差異甲基化區域（DMR）相關基因進行的生物過程GO富集分析。
在SAHH抑制的HUVECs細胞中，通過透射電子顯微鏡（TEM）和MitoTracker Green染色觀察到線粒體形態變短，表明線粒體分裂增加。同時，使用MitoSOX染色檢測到線粒體來源的活性氧（mtROS）水平升高。在SAHH+/-小鼠的主動脈中也觀察到類似的線粒體分裂形態和ROS水平增加。此外，使用mtTEMPO（一種特異性mtROS清除劑）處理可緩解SAHH抑制引起的細胞衰老表型。
圖4：SAHH抑制促進線粒體分裂和mtROS升高。
（4）Drp1-mtROS通路介導SAHH 抑制誘導的內皮衰老
研究發現，SAHH抑制上調Drp1表達，而其他調節線粒體動態的分子（如Fis1、OPA1、MFN1和MFN2）表達未發生變化。通過siRNA或Drp1特異性抑制劑mdivi-1抑制Drp1，可恢復線粒體形態，并減輕SAHH抑制引起的內皮細胞衰老表型。此外，敲低Drp1可抑制SAHH抑制引起的mtROS升高，而清除mtROS對Drp1表達或線粒體形態無影響，表明mtROS增加是Drp1依賴性。
圖5：增強的線粒體分裂和mtROS由Drp1介導。
圖6：Drp1抑制可挽救SAHH抑制誘導的內皮衰老和血管衰老。
（5）SAHH抑制通過Drp1依賴性通路加速動脈粥樣硬化
在APOE-/-小鼠模型中，喂食西方飲食后觀察到主動脈中SA β-gal染色增加、p16、p21和p53蛋白表達上調以及斑塊形成增加。同時，血漿SAH水平升高，SAM/SAH比值降低，SAHH蛋白表達下降，Drp1蛋白表達增加。在SAHH+/-APOE-/-小鼠中，主動脈中SA β-gal染色和油紅O染色的陽性面積增加，表明血管衰老和動脈粥樣硬化加劇。而使用mdivi-1處理可減輕這些表型。
圖7：在ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進展過程中，SAHH水平下降且血管衰老加劇。
圖8：SAHH抑制在Drp1依賴性通路中加速動脈粥樣硬化。
（6）SAHH抑制誘導DRP1啟動子的低甲基化，并通過抑制DNMT1上調Drp1
在SAHH抑制的HUVECs中，通過靶向DRP1基因啟動子區域的亞硫酸鹽測序（Target-BS）分析結果表明，啟動子區域的甲基化水平降低，與轉錄激活相關。體外甲基化實驗表明，甲基化可抑制DRP1啟動子活性。此外，SAHH抑制導致DNMT1表達下調，而過表達DNMT1可抑制SAHH抑制引起的Drp1表達上調。
圖9：SAHH抑制通過抑制DNMT1誘導DRP1啟動子低甲基化和Drp1表達上調。
（A）通過Target-BS檢測經ADA（30μM）處理或轉染SAHH siRNA 48h的HUVECs細胞中DRP1基因啟動子區域的CpG位點甲基化水平。
（B）使用CpG甲基化酶Sss1轉染未甲基化或甲基化的DRP1啟動子的HUVECs，經ADA（30μM）處理或轉染SAHH siRNA 48h。熒光素酶報告基因檢測HUVECs中DRP1啟動子活性（n=3）。
（C）Western Blot分析經ADA（30μM）處理或轉染SAHH siRNA 48h的HUVECs中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的蛋白表達（n=3）。
（D）在ADA和SAHH-siRNA存在的情況下，過表達DNMT1的HUVECs中DNMT1和Drp1的Western Blot分析（n=3）。
（E）轉染DRP1啟動子或對照質粒的HUVECs感染Adv-CT或Adv-DNMT1 24h，然后用ADA（30μM）處理或轉染SAHH siRNA 24h。熒光素酶報告基因檢測HUVECs組中DRP1啟動子活性（n=3）。
易小結
本研究表明，SAHH抑制通過降低DNMT1表達，減少DRP1基因啟動子區域甲基化，導致線粒體動態失衡和mtROS產生增加，最終引起血管衰老和動脈粥樣硬化。研究揭示了SAHH抑制通過表觀遺傳學調控Drp1介導的線粒體分裂，導致血管衰老和動脈粥樣硬化的新機制。SAHH或SAH可作為血管衰老和心血管疾病的潛在治療靶點。這些發現為預防和治療與衰老相關的疾病提供了新的思路。
WGBS和Target-BS在本研究中發揮重要作用
WGBS：WGBS能夠在全基因組范圍內以單堿基分辨率檢測DNA甲基化水平。本研究通過WGBS發現SAHH抑制組的整體甲基化水平較對照組降低，并鑒定出基因組中因SAHH抑制而發生的差異甲基化區域（DMR）。鑒定出的低甲基化區域與Drp1基因表達上調相關，提示其在血管衰老中的潛在作用。
Target-BS：靶基因DNA甲基化測序（Target-BS）技術在本研究中用于分析SAHH抑制對DRP1基因啟動子區域甲基化水平的影響。通過這項技術，研究人員發現SAHH抑制導致DRP1啟動子區域的甲基化水平降低，從而促進Drp1基因的轉錄激活。這一發現揭示了SAHH抑制通過表觀遺傳學機制調控Drp1表達的分子基礎，為理解SAHH在血管衰老和動脈粥樣硬化中的作用提供了關鍵證據。
易基因：DNA甲基化研究基本思路
DNA甲基化一般遵循四個步驟：
首先，進行整體全基因組甲基化變化的分析，包括平均甲基化水平變化、甲基化水平分布變化、降維分析、聚類分析、相關性分析等。
其次，進行甲基化差異水平分析，篩選具體差異基因，包括DMC/DMR/DMG鑒定、DMC/DMR在基因組元件上的分布、DMC/DMR的TF結合分析、時序甲基化數據的分析策略、DMG的功能分析等。
再次，將甲基化組學&轉錄組學關聯分析，包括Meta genes整體關聯、DMG-DEG對應關聯、網絡關聯等。
最后，對篩選出的目標區域DNA甲基化進行驗證，通常采用靶基因重亞硫酸鹽測序（Target-BS）。
參考文獻：
You Y, Chen X, Chen Y, Pang J, Chen Q, Liu Q, Xue H, Zeng Y, Xiao J, Mi J, Tang Y, Ling W. Epigenetic modulation of Drp1-mediated mitochondrial fission by inhibition of S-adenosylhomocysteine hydrolase promotes vascular senescence and atherosclerosis. Redox Biol. 2023 Sep;65:102828. doi: 10.1016/j.redox.2023.102828.
近日，中山大學公共衛生學院營養學系凌文華教授團隊研究探討了抑制SAHH對血管衰老和動脈粥樣硬化的影響及其潛在機制。研究結果表明，抑制SAHH會導致血管內皮細胞衰老，并通過表觀遺傳調控促進線粒體分裂和活性氧（mtROS）水平升高，進而加速動脈粥樣硬化進展。研究結果揭示了SAHH在血管衰老和心血管疾病中的重要作用，并為相關疾病的預防和治療提供了新的靶點。相關研究成果以《EPIgenetic modulation of Drp1-mediated mitochondrial fission by inhibition of S-adenosylhomocysteine hydrolase promotes vascular senescence and atherosclerosis》為題發表于《Redox Biology》期刊。
標題：Epigenetic modulation of Drp1-mediated mitochondrial fission by inhibition of S-adenosylhomocysteine hydrolase promotes vascular senescence and atherosclerosis（通過抑制SAHH對Drp1介導的線粒體分裂的表觀遺傳調控促進血管衰老和動脈粥樣硬化）
發表時間：2023-7-25
發表期刊：Redox Biology
影響因子：IF10.7/Q1
技術平臺：WGBS、Target-BS等
本研究首先通過一項與血管衰老相關的病例對照研究顯示，血漿中SAH水平升高與血管衰老風險呈正相關，比值比（OR）為3.90（95%置信區間，1.17–13.02）。在32周齡的SAHH+/-小鼠的動脈中觀察到脈搏波速度升高、內皮依賴性舒張反應受損以及衰老相關β-半乳糖苷酶染色增加。此外，在體外和體內實驗中，抑制SAHH的血管內皮細胞表現出p16、p21和p53表達增加、線粒體分裂形態以及Drp1表達顯著上調。通過siRNA或其特異性抑制劑mdivi-1進一步下調Drp1，可以恢復異常的線粒體形態，并挽救血管衰老的表型。此外，在APOE-/-小鼠中抑制SAHH會促進血管衰老和動脈粥樣硬化進展，而這種作用可以通過mdivi-1治療得到緩解。從機制上講，SAHH抑制會導致人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中DRP1基因啟動子區域的低甲基化和DNA甲基轉移酶1（DNMT1）下調。
研究結果表明，SAHH抑制通過抑制DNA甲基化在內皮細胞中表觀遺傳性地上調Drp1表達，從而導致血管衰老和動脈粥樣硬化。這些結果表明，SAHH或SAH可以作為血管衰老和心血管疾病的潛在治療靶點。
圖形摘要
研究方法
病例對照研究：選取40-80歲的中老年人群，通過測量肱踝脈搏波速度（baPWV）確定病例組和對照組，分析血漿中SAH和SAM的水平。
動物實驗：使用SAHH雜合敲除小鼠（SAHH+/-）和載脂蛋白E缺陷小鼠（APOE-/-）模型，觀察SAHH抑制對血管衰老和動脈粥樣硬化的影響。
細胞實驗：在人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中通過抑制SAHH，觀察細胞衰老、線粒體分裂和活性氧（mtROS）水平的變化。
分子機制研究：通過基因表達分析、DNA甲基化測序（WGBS、Target-BS）等技術，探討SAHH抑制誘導血管衰老的分子機制。
研究結果
（1）血漿SAH水平與人群的血管衰老有關
在一項包含102名年齡和性別匹配的受試者的病例對照研究中，定義臂踝脈搏波速度 （baPWV）≥1400 cm/s為血管衰老。結果顯示，病例組的血漿SAH水平顯著高于對照組，而SAM/SAH比值則較低。血漿SAH水平與baPWV、頸動脈內膜中層厚度（cIMT）呈正相關，與血流介導的血管擴張（FMD）呈負相關。這表明SAH代謝與血管衰老之間存在相關性。
圖1：血漿SAH水平與人群血管衰老相關
（2）SAHH 抑制誘導血管衰老
在32周齡的SAHH+/-小鼠中，觀察到血漿SAH水平升高，SAM/SAH比值降低，并表現出血管衰老跡象，包括脈搏波速度（PWV）增加、內皮依賴性舒張功能受損以及主動脈中衰老相關β-半乳糖苷酶（SA β-gal）染色增加。此外，細胞衰老主要發生在內皮層。在體外實驗中，使用SAHH抑制劑腺苷二醛（ADA）或SAHH siRNA處理HUVECs，也觀察到SA β-gal染色增加和衰老標志物p16、p21、p53表達上調。
圖2：SAHH抑制誘導血管衰老。
（3）SAHH 抑制促進線粒體分裂并介導mtROS水平上調
鑒于SAHH抑制與DNA低甲基化相關，研究者對經SAHH抑制處理的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）進行全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）以進一步探究其機制。測序結果顯示與對照組相比，SAHH抑制組的整體甲基化水平降低。對測序數據集進行的GO富集分析表明，調節線粒體動態的基因可能介導了SAHH抑制誘導衰老的效果。
圖3： HUVECs細胞轉染SAHH-siRNA 48小時。
（A）基因組DNA甲基化測序示意圖。
（B）功能基因組區域中甲基化胞嘧啶相對密度的基因組特征。
（C）基于WGBS數據，對NC-siRNA組和SAHH-siRNA組之間差異甲基化區域（DMR）相關基因進行的生物過程GO富集分析。
在SAHH抑制的HUVECs細胞中，通過透射電子顯微鏡（TEM）和MitoTracker Green染色觀察到線粒體形態變短，表明線粒體分裂增加。同時，使用MitoSOX染色檢測到線粒體來源的活性氧（mtROS）水平升高。在SAHH+/-小鼠的主動脈中也觀察到類似的線粒體分裂形態和ROS水平增加。此外，使用mtTEMPO（一種特異性mtROS清除劑）處理可緩解SAHH抑制引起的細胞衰老表型。
圖4：SAHH抑制促進線粒體分裂和mtROS升高。
（4）Drp1-mtROS通路介導SAHH 抑制誘導的內皮衰老
研究發現，SAHH抑制上調Drp1表達，而其他調節線粒體動態的分子（如Fis1、OPA1、MFN1和MFN2）表達未發生變化。通過siRNA或Drp1特異性抑制劑mdivi-1抑制Drp1，可恢復線粒體形態，并減輕SAHH抑制引起的內皮細胞衰老表型。此外，敲低Drp1可抑制SAHH抑制引起的mtROS升高，而清除mtROS對Drp1表達或線粒體形態無影響，表明mtROS增加是Drp1依賴性。
圖5：增強的線粒體分裂和mtROS由Drp1介導。
圖6：Drp1抑制可挽救SAHH抑制誘導的內皮衰老和血管衰老。
（5）SAHH抑制通過Drp1依賴性通路加速動脈粥樣硬化
在APOE-/-小鼠模型中，喂食西方飲食后觀察到主動脈中SA β-gal染色增加、p16、p21和p53蛋白表達上調以及斑塊形成增加。同時，血漿SAH水平升高，SAM/SAH比值降低，SAHH蛋白表達下降，Drp1蛋白表達增加。在SAHH+/-APOE-/-小鼠中，主動脈中SA β-gal染色和油紅O染色的陽性面積增加，表明血管衰老和動脈粥樣硬化加劇。而使用mdivi-1處理可減輕這些表型。
圖7：在ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進展過程中，SAHH水平下降且血管衰老加劇。
圖8：SAHH抑制在Drp1依賴性通路中加速動脈粥樣硬化。
（6）SAHH抑制誘導DRP1啟動子的低甲基化，并通過抑制DNMT1上調Drp1
在SAHH抑制的HUVECs中，通過靶向DRP1基因啟動子區域的亞硫酸鹽測序（Target-BS）分析結果表明，啟動子區域的甲基化水平降低，與轉錄激活相關。體外甲基化實驗表明，甲基化可抑制DRP1啟動子活性。此外，SAHH抑制導致DNMT1表達下調，而過表達DNMT1可抑制SAHH抑制引起的Drp1表達上調。
圖9：SAHH抑制通過抑制DNMT1誘導DRP1啟動子低甲基化和Drp1表達上調。
（A）通過Target-BS檢測經ADA（30μM）處理或轉染SAHH siRNA 48h的HUVECs細胞中DRP1基因啟動子區域的CpG位點甲基化水平。
（B）使用CpG甲基化酶Sss1轉染未甲基化或甲基化的DRP1啟動子的HUVECs，經ADA（30μM）處理或轉染SAHH siRNA 48h。熒光素酶報告基因檢測HUVECs中DRP1啟動子活性（n=3）。
（C）Western Blot分析經ADA（30μM）處理或轉染SAHH siRNA 48h的HUVECs中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的蛋白表達（n=3）。
（D）在ADA和SAHH-siRNA存在的情況下，過表達DNMT1的HUVECs中DNMT1和Drp1的Western Blot分析（n=3）。
（E）轉染DRP1啟動子或對照質粒的HUVECs感染Adv-CT或Adv-DNMT1 24h，然后用ADA（30μM）處理或轉染SAHH siRNA 24h。熒光素酶報告基因檢測HUVECs組中DRP1啟動子活性（n=3）。
易小結
本研究表明，SAHH抑制通過降低DNMT1表達，減少DRP1基因啟動子區域甲基化，導致線粒體動態失衡和mtROS產生增加，最終引起血管衰老和動脈粥樣硬化。研究揭示了SAHH抑制通過表觀遺傳學調控Drp1介導的線粒體分裂，導致血管衰老和動脈粥樣硬化的新機制。SAHH或SAH可作為血管衰老和心血管疾病的潛在治療靶點。這些發現為預防和治療與衰老相關的疾病提供了新的思路。
WGBS和Target-BS在本研究中發揮重要作用
WGBS：WGBS能夠在全基因組范圍內以單堿基分辨率檢測DNA甲基化水平。本研究通過WGBS發現SAHH抑制組的整體甲基化水平較對照組降低，并鑒定出基因組中因SAHH抑制而發生的差異甲基化區域（DMR）。鑒定出的低甲基化區域與Drp1基因表達上調相關，提示其在血管衰老中的潛在作用。
Target-BS：靶基因DNA甲基化測序（Target-BS）技術在本研究中用于分析SAHH抑制對DRP1基因啟動子區域甲基化水平的影響。通過這項技術，研究人員發現SAHH抑制導致DRP1啟動子區域的甲基化水平降低，從而促進Drp1基因的轉錄激活。這一發現揭示了SAHH抑制通過表觀遺傳學機制調控Drp1表達的分子基礎，為理解SAHH在血管衰老和動脈粥樣硬化中的作用提供了關鍵證據。
易基因：DNA甲基化研究基本思路
DNA甲基化一般遵循四個步驟：
首先，進行整體全基因組甲基化變化的分析，包括平均甲基化水平變化、甲基化水平分布變化、降維分析、聚類分析、相關性分析等。
其次，進行甲基化差異水平分析，篩選具體差異基因，包括DMC/DMR/DMG鑒定、DMC/DMR在基因組元件上的分布、DMC/DMR的TF結合分析、時序甲基化數據的分析策略、DMG的功能分析等。
再次，將甲基化組學&轉錄組學關聯分析，包括Meta genes整體關聯、DMG-DEG對應關聯、網絡關聯等。
最后，對篩選出的目標區域DNA甲基化進行驗證，通常采用靶基因重亞硫酸鹽測序（Target-BS）。
參考文獻：
You Y, Chen X, Chen Y, Pang J, Chen Q, Liu Q, Xue H, Zeng Y, Xiao J, Mi J, Tang Y, Ling W. Epigenetic modulation of Drp1-mediated mitochondrial fission by inhibition of S-adenosylhomocysteine hydrolase promotes vascular senescence and atherosclerosis. Redox Biol. 2023 Sep;65:102828. doi: 10.1016/j.redox.2023.102828.
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