Targeting Long Noncoding RNA H19 in Subchondral Bone Osteocytes and the Alleviation of Cartilage Degradation in Osteoarthritis

KWS：LncRNA H19；Subchondral Bone Osteocytes；Cartilage Degradation；Osteoarthritis

骨關節炎（OA）是一種常見的關節疾病，其特征是關節軟骨退化、滑膜炎癥和骨重塑。作為關鍵因素之一，據報道機械負荷對軟骨產生抗分解代謝和合成代謝作用，導致軟骨下骨重塑異常。骨細胞（Osteocytes）占骨細胞總數的 90% 至 95%，由于它們在整個骨基質中廣泛分布，并且具有復雜互連的腔隙小管網絡，因此在感應和傳遞機械刺激方面發揮著重要作用。因此，骨細胞可以響應機械信號并分泌可溶性因子來調節破骨細胞和成骨細胞活性。

已發現幾種長鏈非編碼RNA （lncRNAs）與 OA 嚴重程度相關，并在體外影響 OA 關節組織來源的細胞功能。最近的證據主要表明，lncRNA H19（H19）與 OA 中的軟骨和滑膜變化之間存在關聯，但尚未明確關系。此外，H19 通過調節成骨細胞分化、骨再生和骨代謝參與維持骨質量。值得注意的是，H19 已被證明會影響拉伸刺激下骨髓來源的間充質基質細胞的成骨分化能力。因此，有理由假設 H19 可能能夠影響 OA 的軟骨下骨重塑，特別是響應于機械變化，從而可能導致軟骨侵蝕和其他病理變化的進展。

基于此，香港中文大學醫學院骨傷學系及香港城市大學生物醫學工程系團隊的一項研究為了探索靶向 H19 治療 OA 的轉化價值，開發了一種特定的基因遞送系統，將 Fe3O4納米顆粒和金屬有機框架（MOF）結合形成磁性 MOFs（MMOFs），并在外部磁場存在下將抗-H19 反義寡核苷酸（ASO）轉運到軟骨下骨骨細胞中進行體內功能評估。研究成果發表于 Arthritis & Rheumatology期刊題為“Targeting Long Noncoding RNA H19 in Subchondral Bone Osteocytes and the Alleviation of Cartilage Degradation in Osteoarthritis”。從接受全膝關節置換手術的 OA 患者中收集軟骨下骨組織，將軟骨侵蝕嚴重的內側髁軟骨標記為損傷，軟骨相對完整的外側髁軟骨標記為未損傷以進行內部對照比較。H19 的 FISH 染色顯示，損傷組軟骨下骨中 H19 陽性骨細胞的比例顯著高于未損傷組，損傷組軟骨下骨中H19的高表達進一步證實了這一點。在 OA 小鼠模型中，與人類 OA 樣本類似，發現 H19、COX-2、OPG 和 DMP1 的表達顯著上調，特別是在軟骨下骨區域的骨細胞中。這些結果表明，骨細胞 H19 表達上調，并與 OA 軟骨下骨響應機械應力的異常結構變化有關。

為了研究骨細胞 H19 對 OA 的影響，生成骨細胞 H19 cKO 小鼠（圖1 A），其在富含骨細胞的骨組織中顯著降低（圖1 B）。對照H19fl/fl（Flox）小鼠在 DMM 手術后表現出退行性軟骨損傷和軟骨下骨硬化，而 H19 cKO 小鼠幾乎不受 DMM 誘導的變化（圖1 C-E）。正如預期，H19 cKO 小鼠軟骨下骨骨細胞中 H19 上調的程度降低（圖1 C、F），與軟骨下骨細胞中 COX-2、OPG 和 DMP1 的蛋白表達顯著降低有關（圖1 G、H）。這些結果為骨細胞中 H19 的上調可以促進 OA 的發展和軟骨下骨改變提供了支持證據。

圖1 H19 缺失小鼠對 OA 進展和軟骨下骨重塑具有抵抗力。

接下來，為了探索 OA 中 H19 介導的骨細胞機械轉導的分子機制，對 MLO-Y4 細胞采用流體剪切力（FSS，2 Pa）刺激來模擬骨細胞在體內經歷的機械刺激（圖2 A）。FSS 的應用導致 Ptgs2、Tnfrsf11b、Opg/Rankl 比值和 Dmp1 的上調（圖2 B）。值得注意的是，先前的 H19 過表達增強了 MLO-Y4 細胞對 FSS 誘導的這些機械反應基因上調的反應（圖2 B）。相比之下，ASO 敲低 H19 降低了 MLO-Y4 細胞對 FSS 介導的 Ptgs2、Tnfrsf11b、Opg/Rankl 比值和 Dmp1 上調的機械反應（圖2 C）。

然后進行RNA 測序分析，比較 ASO 處理和對照 MLO-Y4 細胞在 FSS 刺激下的變化，以確定潛在的潛在機制。簡而言之，發現 451 個差異表達基因在 FSS 刺激后在 ASO 處理的細胞中的表達水平變化超過 1.5 倍。根據KEGG通路分類，26% 的基因與環境信息處理相關（圖2 E）。值得注意的是，信號轉導是最富集的一種（53.8%），基因集富集分析發現，大多數上調的基因與磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號有關（圖2 D、F）。與之前的結果和 RNA 測序數據一致，PI3K/AKT 信號激活參與骨細胞介導的細胞內機械轉導，AKT 和糖原合成酶激酶3（GSK3）的磷酸化在同時進行 FSS 刺激和 H19 過表達后顯著增加（圖2 G）。隨著 H19 敲低，FSS 刺激未能激活 MLO-Y4 細胞中的 AKT/GSK3 信號通路（圖2 H）。LY290042（一種 PI3K 抑制劑）的預處理阻止了 H19 對 AKT/GSK3 通路激活和機械轉導靶向表達的上調（圖2 I）。這些數據表明，H19 作為 PI3K/AKT/GSK3 信號通路的增強子參與骨細胞的機械反應。圖2 H19 通過 PI3K/AKT/GSK3 信號介導的骨細胞機械反應。

為了進一步研究 H19 對骨細胞機械轉導的下游靶點，比較了 FSS 刺激后 ASO 處理和對照 MLO-Y4 細胞中與 PI3K/AKT/GSK3 信號通路相關的差異表達基因。在因 H19 還原而失調的候選信號轉導基因中，Ppp2r1a 和 Ppp2r5d 屬于蛋白質磷酸酶2A（PP2A）復合酶的亞基基因（圖3 A）。H19 過表達或缺失，獨立于 FSS 刺激，影響了骨細胞中 Ppp2r1a 和 Ppp2r5d 的表達（圖3 B、C）。

為了闡明 PP2A 在 H19 介導的骨細胞機械轉導中的作用，用 DT-601（PP2A 激活劑）或OKA（PP2A 抑制劑）在 FSS 刺激前干擾 PP2A。在 DT-601 存在下，響應 FSS 刺激和 H19 過表達的 Ptgs2、Tnfrsf11b、Opg/Rankl 比率和 Dmp1 的上調表達被消除，而 OKA 恢復了在FSS 刺激下由 H19 敲低引起的這些標記基因的下調（圖3 D、E）。此外，H19 過表達激活的 AKT/GSK3 信號通路被 DT-601 抑制（圖3 F）。相比之下，即使在 H19 缺乏的情況下，OKA 也促進了 AKT/GSK3 信號通路的激活（圖3 G）。這些結果表明，H19 通過 AKT/GSK3 信號通路對骨細胞機械轉導的調節作用可由 PP2A 介導。

為了探討 H19 和 PP2A 之間的相互作用，測定了 H19 過表達或敲低后骨細胞中 PPP2R1A 和 PPP2R5D 的蛋白表達水平，發現 H19 過表達降低其蛋白水平，而 H19 敲低誘導其蛋白水平，表明 H19 可能負向調節 PP2A 的表達。鑒于 H19 主要存在于骨細胞的細胞核中，并且之前報道過 EZH2可被 H19 募集且可激活組蛋白H3賴氨酸27（H3K27me3）的甲基化，因此推測 EZH2 抑制可能參與 H19 介導的 PP2A 抑制。MLO-Y4 細胞通過 H19 過表達證實了 H3K27me3 的誘導，其可被 GSK126（一種選擇性 EZH2 甲基轉移酶抑制劑）顯著抑制（圖3 H）。有趣的是，EZH2 甲基轉移酶抑制以濃度依賴性方式增加 PPP2R1A 和 PPP2R5D 表達。抑制 EZH2 可以抑制 H19 對 PPP2R1A 和 PPP2R5D 表達的抑制作用（圖3 I）。這些研究結果表明，EZH2 通過 PP2A 相關信號通路對 H19 介導的骨細胞機械轉導具有合理的調節作用。

圖3 通過 PP2A 調控H19 介導的骨細胞機械反應和機械轉導。

最后，為了通過調節軟骨下骨重塑來確認 H19 作為 OA 治療靶點的潛力，設計了一個 MMOF 納米平臺，以可控方式將抗-H19 ASO 輸送到靶點，ASO 成功與 MMOF 偶聯。ASO 釋放曲線表明，54% 的 ASO 在前 3 小時內釋放，而在釋放培養基中孵育 6 小時后釋放百分比達到最大值。此外，在體外補充 MMOF 后有效抑制骨細胞中 H19 表達揭示了 MMOF 將 ASO 遞送到具有適當生物利用度的細胞的能力。

采用體內熒光成像驗證磁場暴露下 MMOF 在膝關節中的有效積累。吲哚菁綠（ICG）標記的 MMOF 的熒光強度主要積累在暴露于外部磁場的目標膝關節中，而沒有磁場暴露的對側顯示出微弱的熒光信號（圖4 A、B）。注射后 6 小時磁場暴露，負載有 ASO 的 MMOF 在膝關節的有效積累得到了證實的，因為與在整個研究期間沒有磁刺激的樣本相比，這些樣本中的熒光信號在膝關節中顯著更高（圖4 C）。由于 MMOF 一旦暴露在磁場中，就可以在關節中保留更長的時間，因此它們在暴露于磁場時會延遲循環到其他器官。MMOF 注射 24 小時后切除器官和膝關節的離體圖像顯示，肝臟和腎臟中具有顯著的熒光信號，表明在后續治療中其他器官可能存在毒性積累（圖4 D）。

用 DMM 誘導的 OA 小鼠模型評估負載 ASO 的 MMOF 的治療效果。治療 8 周后，接受磁引導、ASO 負載 MMOF 治療的小鼠軟骨降解和軟骨下骨硬化顯著緩解。在沒有磁場的情況下，骨關節炎OARSI評分和軟骨下骨硬化有細微的改善（圖4 E-G）。FISH 染色結果證實，單獨負載 ASO 的 MMOF 治療略微降低了骨細胞 H19 在軟骨下骨區域的分布，而一旦與磁場結合，觀察到對 H19 陽性骨細胞的顯著抑制（圖4 E、H）。暴露于磁場后，MMOF 注射顯著降低 OA 軟骨下骨細胞中 COX-2、OPG 和 DMP1 的表達。 圖4 MMOF 的體內治療。

圖5 圖形概要

總之，這項結果提供了新的證據，表明骨細胞中 H19 表達升高可能導致異常的軟骨下骨重塑和 OA 進展。H19 似乎是骨細胞對機械刺激的反應所必需的，靶向 H19 代表了 OA 治療的一種新的有前途的方法。

參考文獻：Wang R, Mehrjou B, Dehghan-Banian D, Wang BYH, Li Q, Deng S, Liu C, Zhang Z, Zhu Y, Wang H, Li D, Lu X, Cheng JCY, Ong MTY, Chan HF, Li G, Chu PK, Lee WYW. Targeting Long Noncoding RNA H19 in Subchondral Bone Osteocytes and the Alleviation of Cartilage Degradation in Osteoarthritis. Arthritis Rheumatol. 2024 Oct 31. doi: 10.1002/art.43028. Epub ahead of print. PMID: 39482250.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39482250/

Online ISSN:2326-5205

Print ISSN:2326-5191

Journal Impact Factor (Clarivate):11.4

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